Введение

Биомолекула

Малая интерферирующая РНК (siRNA), иногда известная как короткая интерферирующая РНК или РНК, подавляющая экспрессию генов, представляет собой класс двухцепочечных некодирующих молекул РНК, обычно длиной 20–24 (обычно 21) пары оснований, схожих с миРНК, и функционирующих в рамках пути интерференции РНК (РНКi). Она вмешивается в экспрессию специфических генов, имеющих комплементарные нуклеотидные последовательности, путем деградации мРНК после транскрипции, предотвращая трансляцию. Она была открыта в 1998 году Эндрю Файром из Института Карнеги в Вашингтоне и Крейгом Мелло из Университета Массачусетса в Ворчестере.

Структура

Природно встречающиеся siРНК имеют чётко определённую структуру: это короткая (обычно 20–24 пары оснований) двухцепочечная РНК (dsРНК) с фосфорилированными 5'-концами и гидроксилированными 3'-концами, имеющая двухнуклеотидные свесы. Фермент Дицера катализирует образование siРНК из длинных dsРНК и коротких двухцепочечных РНК-структур в виде шпилек. siРНК также могут быть введены в клетки посредством трансфекции. Поскольку, в принципе, любой ген может быть подавлен синтетической siРНК с комплементарной последовательностью, siРНК являются важным инструментом для подтверждения функции генов и разработки лекарственных препаратов в постгеномную эпоху.

История

В 1998 году Эндрю Файр из Института науки Карнеги в Вашингтоне и Крейг Мелло из Массачусетского университета в Ворчестере обнаружили механизм РНКи, работая над экспрессией генов у нематоды *Caenorhabditis elegans*. Они получили Нобелевскую премию за исследования в области РНКи в 2006 году. siРНК и их роль в посттранскрипционном глушении генов (PTGS) были обнаружены в растениях группой Дэвида Боулкомба в лаборатории Сайнсбери в Норвиче, Англия, и опубликованы в журнале *Science* в 1999 году. Томас Тушль и его коллеги вскоре сообщили в журнале *Nature*, что синтетические siРНК могут индуцировать РНКи в клетках млекопитающих. В 2001 году экспрессию конкретного гена удалось успешно подавить путем введения химически синтезированной siРНК в клетки млекопитающих (Tuschl et al.). Эти открытия вызвали всплеск интереса к использованию РНКи для биомедицинских исследований и разработки лекарственных препаратов. Значительные успехи в терапии с использованием siРНК были достигнуты как с органическими (углеродными), так и с неорганическими (неуглеродными) наночастицами, которые успешно применялись для доставки лекарств в мозг, предлагая перспективные методы доставки терапевтических средств человеку. Однако применение siРНК у людей сталкивалось со значительными ограничениями, снижающими его эффективность. Одной из таких проблем является нецелевое воздействие.

Индукция RNAi с использованием siRNA или их биосинтетических прекурсоров

Устранение генов с помощью трансфекции экзогенной сиРНК часто бывает неудовлетворительным, поскольку эффект лишь временный, особенно в быстро делящихся клетках. Это можно преодолеть, создав экспрессионный вектор для сиРНК. Последовательность сиРНК модифицируется для введения короткой петли между двумя цепями. Полученный транскрипт представляет собой короткую двухцепочечную РНК (shRNA), которая может быть обработана Dicer в функциональную сиРНК обычным образом. Типичные транскрипционные кассеты используют промотор РНК-полимеразы III (например, U6 или H1) для направления транскрипции малых ядерных РНК (snRNAs) (U6 участвует в сплайсинге РНК; H1 является RNase-компонентом человеческого RNase P). Считается, что полученный транскрипт сиРНК затем обрабатывается Dicer. Эффективность подавления генов также может быть повышена с помощью сжатия клеток. Активность сиРНК в РНК-интерференции во многом зависит от ее способности связываться с РНК-индуцированным комплексом тишины (RISC). Связывание двухцепочечной сиРНК с RISC сопровождается раскручиванием и расщеплением смысловой цепи эндонуклеазами. Оставшийся антисмысловой цепью комплекс RISC затем может связываться с целевыми мРНК для инициирования транскрипционного подавления.

Активация РНК

Было обнаружено, что двуцепочечная РНК (дсРНК) также может активировать экспрессию генов, механизм, который получил название "активация генов, индуцированная малыми РНК" или РНКа. Показано, что дсРНК, нацеленные на промоторы генов, индуцируют мощную транскрипционную активацию соответствующих генов. РНКа была продемонстрирована в клетках человека с использованием синтетических дсРНК, называемых "малыми активирующими РНК" (saРНК). В настоящее время не известно, насколько РНКа распространена у других организмов. Одно исследование на комаре Aedes aegypti показало наличие некоторых свидетельств РНКа, которую можно достичь с помощью коротких или длинных дсРНК, нацеленных на промоторные области.

Посттранскрипционное подавление генов

Индуцированное siRNA посттранскрипционное глушение генов инициируется сборкой РНК-индуцированного комплекса глушения (RISC). Этот комплекс подавляет экспрессию определенных генов, расщепляя молекулы мРНК, кодирующие целевые гены. Для начала процесса одна из двух нитей siRNA, направляющая нить (антисенсорная нить), загружается в RISC, а другая нить, пассажирская нить (сенсорная нить), деградирует. Определенные ферменты Dicer могут отвечать за загрузку направляющей нити в RISC. Затем siRNA сканирует и направляет RISC к идеально комплементарной последовательности на молекулах мРНК. Считается, что расщепление молекул мРНК катализируется доменом Piwi белков Argonaute в составе RISC. Молекула мРНК затем прецизионно разрезается путем расщепления фосфодиэфирной связи между целевыми нуклеотидами, спаренными с остатками 10 и 11 siRNA, отсчитываемыми от 5'-конца. Это расщепление приводит к образованию фрагментов мРНК, которые далее деградируют клеточными экзонуклеазами. 5'-фрагмент деградирует с 3'-конца экзосомой, а 3'-фрагмент деградирует с 5'-конца 5'-3' экзорибонуклеазой 1 (XRN1). Диссоциация целевой нити мРНК от RISC после расщепления позволяет глушить большее количество мРНК. Этот процесс диссоциации, вероятно, стимулируется внешними факторами, обусловленными гидролизом АТФ. PIWI-интерактивные РНК (piRNAs) – это недавно открытый класс малых некодирующих РНК (ncRNAs) длиной 21–35 нуклеотидов. Они играют роль в регуляции экспрессии генов, подавлении транспозонов и ингибировании вирусных инфекций. Ранее считавшиеся «темной материей» ncRNA, piRNAs стали важными участниками множественных клеточных функций в различных организмах.

Заглушение транскрипционного гена

Многие модельные организмы, такие как растения (Arabidopsis thaliana), дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), мухи (Drosophila melanogaster) и черви (C. elegans), использовались для изучения небольших некодирующих РНК, направленных на транскрипционное глушение генов. В клетках человека РНК-опосредованное транскрипционное глушение генов было впервые обнаружено около десяти лет назад, когда экзогенные siРНК подавляли активность трансгенного промотора удлинительного фактора 1α, контролирующего экспрессию гена-репортера зеленого флуоресцентного белка (GFP). Основные механизмы транскрипционного глушения генов (TGS), включающие РНК-интерференцию, включают метилирование ДНК, посттрансляционные модификации гистонов и последующую перестройку хроматина вокруг целевого гена в гетерохроматическое состояние. При попадании в клетку млекопитающего двухцепочечной РНК, такой как siРНК, она может быть ошибочно воспринята как вирусный продукт, что приводит к активации иммунного ответа. Более того, поскольку структурно родственные микроРНК модулируют экспрессию генов преимущественно за счет неполного комплементарного спаривания оснований с целевой мРНК, введение siРНК может вызывать нежелательное воздействие на другие гены. Химические модификации siРНК могут изменять термодинамические свойства, что также приводит к снижению однонуклеотидной специфичности.

Врожденный иммунитет

Введение слишком большого количества малых интерферирующих РНК (siRNA) может приводить к неспецифическим эффектам из-за активации врожденного иммунного ответа. Большинство имеющихся данных свидетельствуют о том, что это, вероятно, связано с активацией dsRNA-сенсора PKR, хотя в этот процесс может быть вовлечен и ген, индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG I). Также описана индукция цитокинов посредством Toll-подобного рецептора 7 (TLR7). Химическая модификация siRNA используется для снижения активации врожденного иммунного ответа в целях изучения функции генов и терапевтических применений. Одним из перспективных способов уменьшения неспецифических эффектов является преобразование siRNA в микроРНК. МикроРНК встречаются в организме естественным образом, и, используя этот эндогенный путь, можно добиться аналогичного подавления экспрессии генов при сравнительно низких концентрациях полученных siRNA. Это должно минимизировать неспецифические эффекты.

Нецелевое наведение

Нецелевое воздействие — еще одна проблема при использовании siRNA в качестве инструмента для подавления экспрессии генов. Инструмент для предсказания нецелевых эффектов siRNA доступен по адресу http://crdd.osdd.net/servers/aspsirna/asptar.php и опубликован как ресурс ASPsiRNA.

Адаптирующий иммунный ответ

Простые РНК могут быть слабыми иммуногенами, но антитела к РНК-белковым комплексам могут быть созданы легко. Многие аутоиммунные заболевания характеризуются наличием подобных антител. Сообщений об антителах к сиРНК, связанной с белками, пока не поступало. Некоторые методы доставки сиРНК включают присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к олигонуклеотиду, что снижает выведение из организма и увеличивает период полувыведения в кровотоке. Однако недавно крупное клиническое исследование III фазы, в котором использовался ПЭГ-модифицированный РНК-аптамер против фактора IX, было приостановлено компанией Regado Biosciences из-за серьезной анафилактической реакции на ПЭГ-фрагмент РНК. Эта реакция в некоторых случаях приводила к летальному исходу и вызывает серьезные опасения относительно доставки сиРНК при использовании олигонуклеотидов, конъюгированных с ПЭГ.

Насыщение механизма RNAi

Трансфекция siRNA в клетки обычно снижает экспрессию многих генов, однако также наблюдается повышение экспрессии генов. Повышение экспрессии генов может быть частично объяснено предсказанными мишенями эндогенных miRNA. Компьютерный анализ более чем 150 экспериментов по трансфекции siRNA подтверждает модель, согласно которой экзогенные siRNA могут насыщать эндогенный механизм РНК-интерференции, что приводит к дерепрессии генов, регулируемых эндогенными miRNA. Таким образом, хотя siRNA могут вызывать нежелательные побочные эффекты, то есть непреднамеренное снижение экспрессии мРНК из-за частичного совпадения последовательностей между siRNA и мишенью, насыщение механизма РНК-интерференции является другим, отличным неспецифическим эффектом, который включает в себя дерепрессию генов, регулируемых miRNA, и приводит к аналогичным проблемам при интерпретации данных и потенциальной токсичности.

Химическая модификация

siРНК были химически модифицированы для улучшения их терапевтических свойств. Для реализации терапевтического потенциала РНКи, короткая интерферентная РНК (siРНК) должна быть доставлена к месту действия в клетки целевых тканей. Подробная база данных всех таких химических модификаций вручную составляется и представлена в научной литературе как siRNAmod. Химическая модификация сиРНК также может непреднамеренно приводить к потере специфичности к отдельным нуклеотидам.

Терапевтические применения и проблемы

Учитывая способность подавлять, по сути, любой интересующий ген, РНКи посредством siРНК вызвали значительный интерес как в фундаментальной, так и в прикладной биологии. Одной из основных проблем для терапевтических средств на основе siRNA и RNAi является внутриклеточная доставка. siRNA также обладает низкой стабильностью и неблагоприятными фармакокинетическими свойствами. Доставка siRNA с помощью наночастиц показала перспективность, однако продемонстрировала лишь умеренную эффективность в локальных участках доставки, таких как человеческий глаз. Доставка чистой ДНК в целевые организмы затруднена из-за ее большого размера и структуры, препятствующих легкому диффундированию через мембраны. Это позволяет осуществлять доставку с использованием наномасштабных транспортных средств, называемых нановекторами. Показано, что siRNA, доставляемые с помощью липидных наночастиц, обладают терапевтическим потенциалом при заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС). Заболевания центральной нервной системы не редкость, но гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) часто препятствует проникновению потенциальных терапевтических средств в мозг. Результаты первой фазы первых двух терапевтических исследований RNAi (для лечения возрастной макулярной дегенерации, также известной как AMD), представленные в конце 2005 года, показали, что siRNA хорошо переносятся и обладают подходящими фармакокинетическими свойствами. В клиническом исследовании фазы 1 41 пациенту с прогрессирующим раком, метастазировавшим в печень, вводили RNAi, доставляемые через липидные наночастицы. RNAi были направлены на два гена, кодирующих ключевые белки, участвующие в росте раковых клеток: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и белок шпинделя кинезина (KSP). Результаты продемонстрировали клиническую пользу: у некоторых пациентов рак либо стабилизировался через шесть месяцев, либо наблюдалась регрессия метастазов. Фармакодинамический анализ образцов биопсии пациентов выявил наличие конструкций RNAi в образцах, что подтверждает достижение молекул намеченной цели. Исследования, подтверждающие концепцию, показали, что siРНК, нацеленные на вирус Эбола, могут быть эффективны в качестве постэкспозиционной профилактики у людей, при этом 100% нечеловеческих приматов выжили после летальной дозы вируса Эбола Заир, наиболее смертоносного штамма.

Юридическая классификация и юридические вопросы в ближайшем будущем

В настоящее время siRNA химически синтезируются и, следовательно, юридически классифицируются в ЕС и США как простые лекарственные препараты. Однако, поскольку разрабатываются биоинженерные siRNA (BERAs), они будут классифицироваться как биологические лекарственные препараты, по крайней мере в ЕС. Разработка технологии BERAs ставит вопрос о классификации лекарственных средств с одинаковым механизмом действия, но производимых химическим или биологическим способом. Эта непоследовательность должна быть устранена.

Внутриклеточная доставка

Существует значительный потенциал для терапевтического использования интерференции РНК (РНКi) для обратимого «выключения» любого гена. Для реализации этого терапевтического потенциала, малые интерферирующие РНК (siРНК) должны быть доставлены к месту действия – в клетки целевых тканей. Однако поиск безопасных и эффективных механизмов доставки является серьезным препятствием на пути к полной реализации потенциала терапии на основе siРНК. Немодифицированная siРНК нестабильна в кровотоке, может вызывать иммуногенность и испытывает трудности при проникновении через клеточные мембраны. Поэтому для безопасной доставки siРНК к месту действия необходимы химические модификации и/или средства доставки. Этот метод имеет преимущество, поскольку позволяет доставлять siРНК в большинство типов клеток, отличается высокой эффективностью и воспроизводимостью и доступен в коммерческой продаже. Наиболее распространенными коммерческими реагентами для трансфекции siРНК являются Lipofectamine и Neon Transfection. Тем не менее, он не подходит для всех типов клеток и обладает низкой эффективностью in vivo.

Электропорация

Электрические импульсы также используются для внутриклеточной доставки siRNA в клетки. Клеточная мембрана состоит из фосфолипидов, что делает её восприимчивой к электрическому полю. При подаче быстрых, но мощных электрических импульсов молекулы липидов переориентируются, претерпевая тепловые фазовые переходы из-за нагрева. Это приводит к образованию гидрофильных пор и локальных нарушений в липидном бислое клеточной мембраны, а также к временной потере полупроницаемости. Это позволяет высвобождению множества внутриклеточных компонентов, таких как ионы и метаболиты, и одновременному поглощению лекарственных средств, молекулярных зондов и нуклеиновых кислот. Электропорация особенно полезна для клеток, которые трудно трансфицировать, однако при использовании этой техники повышается вероятность гибели клеток. Этот метод был использован для доставки siRNA, нацеленного на VEGF, в ксенотрансплантированные опухоли у мышей с дефицитом иммунитета, что привело к значительному подавлению роста опухоли.

Вирусные роды

Эффекты подавления генов, вызванные трансфицированной специально разработанной siRNA, обычно носят временный характер, но эту проблему можно решить, используя подход RNAi. Доставка этой siRNA из ДНК-матриц может осуществляться с помощью нескольких рекомбинантных вирусных векторов на основе ретровируса, аденоассоциированного вируса, аденовируса и лентивируса. Последний является наиболее эффективным вирусом, обеспечивающим стабильную доставку siRNA в клетки-мишени, поскольку он способен трандуцировать не делящиеся клетки и напрямую проникать в ядро. Эти специфические вирусные векторы были разработаны для эффективной доставки siRNA, которую невозможно эффективно трансфицировать в клетки. Кроме того, в некоторых случаях синтетические вирусные векторы могут интегрировать siRNA в геном клетки, что обеспечивает стабильную экспрессию siRNA и длительное подавление генов. Этот метод имеет преимущество, поскольку он in vivo и эффективен для клеток, которые трудно трансфицировать. Однако возникают проблемы, так как он может вызывать противовирусные реакции в некоторых типах клеток, приводящие к мутагенным и иммуногенным эффектам. Этот метод имеет потенциал для использования в подавлении генов центральной нервной системы при лечении болезни Гентингтона.

Лечение

Через десять лет после открытия механизма РНКи в 1993 году фармацевтический сектор активно инвестировал в исследования и разработку терапии на основе малых интерферирующих РНК (siRNA). Эта терапия обладает рядом преимуществ по сравнению с малыми молекулами и антителами. Её можно вводить раз в квартал или каждые шесть месяцев. Другое преимущество заключается в том, что, в отличие от малых молекул и моноклональных антител, которым необходимо распознавать специфическую конформацию белка, siRNA функционирует за счет спаривания оснований Уотсона-Крика с мРНК. Таким образом, любую молекулу-мишень, требующую лечения с высокой аффинностью и специфичностью, можно выбрать, если доступна соответствующая нуклеотидная последовательность. Ниже приведены некоторые одобренные и разрабатываемые методы лечения.

Alnylam Pharmaceuticals

В 2018 году Alnylam Pharmaceuticals стала первой компанией, у которой терапия на основе siRNA была одобрена FDA. Препарат Onpattro (патизиран) был одобрен для лечения полиневропатии, вызванной наследственным транстиретиновым амилоидозом (hATTR), у взрослых. hATTR – это редкое, прогрессирующее и изнуряющее заболевание. При hATTR амилоидозе неправильно свернутый белок транстиретина (TTR) откладывается во внеклеточном пространстве. В нормальных условиях тетрамеры TTR состоят из четырех мономеров. Наследственный амилоидоз ATTR вызывается дефектом или мутацией в гене транстиретина (TTR), который наследуется. Изменение всего лишь одной аминокислоты изменяет структуру тетрамерных белков транстиретина, приводя к образованию нестабильных тетрамеров, которые агрегируют в мономеры и формируют нерастворимые внеклеточные амилоидные отложения. Накопление амилоида в различных органах и системах вызывает кардиомиопатию, полиневропатию и нарушения функции желудочно-кишечного тракта. Заболевание поражает 50 000 человек во всем мире. Для доставки препарата непосредственно в печень siRNA помещается в липидную наночастицу. Молекула siRNA блокирует выработку амилоидных белков, вмешиваясь в процесс производства РНК аномальных белков TTR. Это предотвращает накопление этих белков в различных органах и помогает пациентам контролировать заболевание. Традиционно, трансплантация печени является стандартным методом лечения наследственного транстиретинового амилоидоза, однако ее эффективность может быть ограничена сохраняющимся отложением амилоида транстиретина дикого типа после трансплантации. Существуют также препараты с малыми молекулами, которые обеспечивают лишь временное облегчение. До появления Onpattro возможности лечения hATTR были ограничены. После одобрения Onpattro FDA присвоило Alnylam статус «прорывной терапии», который присваивается препаратам, предназначенным для лечения серьезных заболеваний и представляющим собой значительный прогресс по сравнению с существующими методами лечения. Препарат также получил статус лекарственного средства-сироты, предназначенного для безопасного лечения заболеваний, поражающих менее 200 000 человек. Помимо Onpattro, был разработан еще один препарат для РНК-интерференции (партизиран), обладающий способностью ингибировать синтез транстиретина в печени. В результате, целевая матричная РНК (мРНК) расщепляется малыми интерферирующими РНК, связанными с комплексом, индуцирующим сайленсинг РНК. Патисиран, исследуемый препарат РНКi, использует этот процесс для снижения выработки мутантного и дикого типа транстиретина путем расщепления в 3'-нетранслируемой области мРНК транстиретина. В 2019 году FDA одобрило вторую терапию на основе RNAi – Givlaari (гивосиран) – для лечения острой перемежающейся порфирии (AHP). Заболевание вызвано накоплением токсичных молекул порфобилиногена (PBG), образующихся в процессе синтеза гема. Эти молекулы накапливаются в различных органах, что может приводить к симптомам или приступам AHP. Givlaari – это препарат siRNA, который снижает экспрессию аминолевулинатсинтазы 1 (ALAS1), печеночного фермента, участвующего в ранней стадии синтеза гема. Снижение экспрессии ALAS1 уменьшает уровень нейротоксических промежуточных продуктов, вызывающих симптомы AHP. Другие компании, добившиеся успеха в разработке препаратов на основе siRNA, включают Dicerna Pharmaceuticals (в партнерстве с Eli Lilly and Company) и Arrowhead Pharmaceuticals (в партнерстве с Johnson and Johnson). Крупные фармацевтические компании, такие как Amgen и AstraZeneca, также активно инвестируют в разработку терапии на основе siRNA, видя потенциал успеха в этой области биологических препаратов.