Введение

Энзим, который расщепляет двухцепочечную РНК (dsRNA) на короткие фрагменты dsRNA.

Dicer, также известный как эндорибонуклеаза Dicer или геликаза с мотивом RNase, – это фермент, кодируемый геном у человека. Являясь частью семейства RNase III, Dicer расщепляет двухцепочечную РНК (dsRNA) и пре-микроРНК (pre miRNA) на короткие двухцепочечные РНК-фрагменты, называемые малыми интерферирующими РНК и микроРНК соответственно. Эти фрагменты имеют длину примерно 20–25 пар оснований с двухнуклеотидным свесом на 3'-конце. Dicer способствует активации РНК-индуцированного комплекса глушения (RISC), который необходим для РНК-интерференции. RISC содержит каталитический компонент Argonaute, являющийся эндонуклеазой, способной расщеплять матричную РНК (мРНК).

Открытие

Дицер получил свое название в 2001 году аспиранткой Stony Brook Эмили Бернштейн во время исследований в лаборатории Грегори Ханнона в Cold Spring Harbor Laboratory. Бернштейн стремилась обнаружить фермент, ответственный за образование коротких фрагментов РНК из двухцепочечной РНК. Способность Дицера генерировать фрагменты РНК длиной около 22 нуклеотидов была установлена путем отделения его от ферментного комплекса RISC после запуска пути РНК-интерференции трансфекцией двухцепочечной РНК. Этот эксперимент показал, что RISC не отвечает за образование наблюдаемых коротких нуклеотидных фрагментов. Последующие эксперименты, направленные на изучение способности ферментов семейства RNase III создавать фрагменты РНК, сузили поиск до Drosophila CG4792, который впоследствии был назван Дицером. Ортологи Дицера присутствуют во многих других организмах. У мха Physcomitrella patens DCL1b, один из четырех белков DICER, не участвует в биогенезе микроРНК, а участвует в разрезании миРНК-таргетных транскриптов. Таким образом, был открыт новый механизм регуляции экспрессии генов – эпигенетическое подавление генов микроРНК. Что касается кристаллической структуры, первым исследованным Дицером был фермент из простейшего Giardia intestinalis. Работа была выполнена Иэном МакРэем во время исследований в качестве постдока в лаборатории Дженнифер Дудна в Калифорнийском университете в Беркли. Домен PAZ и два домена RNase III были обнаружены с помощью рентгеновской кристаллографии. Размер белка составляет 82 кДа, что представляет собой консервативное функциональное ядро, которое впоследствии было обнаружено в более крупных белках Дицера у других организмов; например, у человека он составляет 219 кДа. Разница в размере между человеческим Дицером и Дицером G. intestinalis обусловлена наличием как минимум пяти различных доменов в человеческом Дицере. Эти домены важны для регуляции активности Дицера, обработки двухцепочечной РНК и функционирования факторов РНК-интерференции.

Функциональные области

Дицер человека (также известный как hsDicer или DICER1) классифицируется как рибонуклеаза III, поскольку он расщепляет двухцепочечную РНК. Помимо двух доменов RNaseIII, он содержит домен геликазы, домен PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) и два домена, связывающих двухцепочечную РНК (DUF283 и dsRBD). Современные исследования показывают, что домен PAZ способен связывать двухнуклеотидный 3'-выступ на двухцепочечной РНК, в то время как каталитические домены RNaseIII формируют псевдодимер вокруг двухцепочечной РНК для инициирования расщепления цепей. Это приводит к функциональному укорочению двухцепочечной РНК. Расстояние между доменами PAZ и RNaseIII определяется углом соединительной спирали и влияет на длину продукта микроРНК. Домен геликазы участвует в обработке длинных субстратов.

Микро РНК

РНК-интерференция – это процесс, в котором расщепление молекул РНК на микроРНК (миРНК) подавляет экспрессию генов специфических последовательностей мРНК хозяина. МиРНК образуется внутри клетки, начиная с первичной миРНК (pri-миРНК) в ядре. Эти длинные последовательности расщепляются до более коротких предшественников миРНК (pre-миРНК), которые обычно состоят из 70 нуклеотидов и имеют шпилечную структуру. Pri-миРНК распознаются DGCR8 и расщепляются Drosha с образованием pre-миРНК, этот процесс происходит в ядре. Затем pre-миРНК экспортируются в цитоплазму, где Dicer расщепляет их, формируя зрелую миРНК.

Малая интерферирующая РНК

Малые интерферирующие РНК (siRNA) образуются и функционируют схожим образом с миРНК, расщепляя двухцепочечную РНК ферментом Dicer на более короткие фрагменты длиной от 21 до 23 нуклеотидов. Это, в свою очередь, приводит к подавлению экспрессии конкретного гена посредством РНК-интерференции. siRNA и miRNA различаются тем, что siRNA обычно специфичны к последовательности мРНК, в то время как miRNA не обладают полной комплементарностью к последовательности мРНК. miRNA могут взаимодействовать с мишенями, имеющими сходные последовательности, что ингибирует трансляцию различных генов. В целом, РНК-интерференция является важной частью нормальных процессов в организмах, включая человека, и активно исследуется как диагностический и терапевтический инструмент для воздействия на раковые клетки.

Рак

Измененные профили экспрессии микроРНК при злокачественных новообразованиях указывают на ключевую роль микроРНК и, следовательно, дицера в развитии рака и прогнозе заболевания. МикроРНК могут функционировать как супрессоры опухолей, и поэтому изменение их экспрессии может приводить к опухолеобразованию. При анализе рака легких и яичников, неблагоприятный прогноз и сокращение времени выживания пациентов коррелируют со снижением экспрессии дицера и дроши. Снижение уровня мРНК дицера коррелирует с более поздней стадией опухоли. Однако, высокая экспрессия дицера при других видах рака, таких как рак предстательной железы и пищевода, показала связь с неблагоприятным прогнозом для пациентов. Это расхождение между различными типами рака предполагает, что уникальные регуляторные процессы РНК-интерференции, связанные с дицером, различаются в разных типах опухолей.

Вирусная патогенез

Инфекция РНК-вирусами может запускать каскад РНК-интерференции. Вероятно, дицер участвует в противовирусном иммунитете, поскольку вирусы, инфицирующие как растительные, так и животные клетки, содержат белки, предназначенные для подавления ответа РНК-интерференции. У человека вирусы ВИЧ-1, гриппа и вакциния кодируют такие белки, подавляющие РНК-интерференцию. Ингибирование дицера выгодно для вируса, так как дицер способен расщеплять вирусную двухцепочечную РНК и загружать продукт в комплекс RISC, что приводит к направленной деградации вирусной мРНК и, таким образом, борьбе с инфекцией. Другим потенциальным механизмом вирусного патогенеза является блокада дицера как способа ингибирования клеточных путей микроРНК.

У насекомых

У дрозофилы Dicer 1 генерирует микроРНК (miRNAs) путем обработки пре-миРНК, а Dicer 2 отвечает за производство малых интерферирующих РНК (siRNAs) из длинной двухцепочечной РНК (dsRNA). Насекомые могут использовать Дицер как мощное противовирусное средство. Это открытие особенно важно, учитывая, что комары являются переносчиками многих вирусных заболеваний, включая потенциально смертельные арбовирусы: вирус Западного Нила, лихорадку денге и желтую лихорадку. Хотя комары, в частности вид Aedes aegypti, служат векторами этих вирусов, они не являются естественными хозяевами для них. Передача происходит из-за потребности самки комара в крови позвоночных для развития яиц. Путь РНК-интерференции (RNAi) у насекомых очень похож на таковой у других животных: Dicer 2 расщепляет вирусную РНК и загружает ее в комплекс RISC, где одна цепь служит матрицей для производства продуктов РНК-интерференции, а другая деградирует. Насекомые с мутациями, приводящими к нефункциональным компонентам их пути РНК-интерференции, демонстрируют повышенную вирусную нагрузку для переносимых ими вирусов или повышенную восприимчивость к вирусам, хозяевами которых они являются. Подобно тому, как это происходит у людей, вирусы насекомых выработали механизмы для обхода пути РНК-интерференции. Например, вирус Drosophila C кодирует белок 1A, который связывается с двухцепочечной РНК, защищая ее от расщепления Дицером и загрузки в комплекс RISC. Heliothis virescens ascovirus 3a кодирует фермент RNase III, подобный RNase III доменам Дицера, который может конкурировать за субстрат dsRNA, а также разрушать дуплексы siRNA, предотвращая загрузку в RISC.

Диагностическое и терапевтическое применение

Дисер можно использовать для выявления наличия опухолей в организме, основываясь на уровне экспрессии этого фермента. Исследование показало, что у многих пациентов с раком наблюдалось снижение уровня экспрессии Дицера. То же исследование продемонстрировало, что более низкая экспрессия Дицера коррелирует с меньшей продолжительностью жизни пациентов. Показано, что siRNA может доставляться двумя способами у млекопитающих, например, у мышей. Один из способов – непосредственное введение в организм, не требующее функции Дицера. Другой способ – введение с помощью плазмид, кодирующих короткие двухцепочечные РНК, которые расщепляются Дицером до siRNA. Одним из преимуществ использования Дицера для терапевтического производства siRNA является его специфичность и разнообразие мишеней, по сравнению с используемыми в настоящее время подходами, такими как антитела или малые молекулярные ингибиторы. В целом, малые молекулярные ингибиторы сложны в плане специфичности и часто вызывают непереносимые побочные эффекты. Антитела столь же специфичны, как и siRNA, но их применение ограничено только лигандами или поверхностными рецепторами. С другой стороны, низкая эффективность внутриклеточного поглощения является основным препятствием для введения siRNA. Кроме того, терапевтическое использование miRNA ограничено в специфичности, поскольку для связывания miRNA с мРНК требуется всего 6-8 пар нуклеотидных оснований.

Дицер-подобные белки

Геном растений кодирует белки, подобные дисеру, с аналогичными функциями и белковыми доменами, как у дисера животных и насекомых. Например, в модельном организме Arabidopsis thaliana синтезируются четыре белка, подобных дисеру, обозначенные как DCL1–DCL4. DCL1 участвует в образовании микроРНК и производстве малых РНК из инвертированных повторов. DCL2 создает малые интерферирующие РНК (siRNA) из антисмысловых транскриптов с цис-действием, которые способствуют иммунитету и защите от вирусов. DCL3 генерирует siRNA, участвующую в модификации хроматина, а DCL4 вовлечен в метаболизм транс-действующей siRNA и подавление транскриптов на посттранскрипционном уровне. Кроме того, DCL1 и DCL3 важны для цветения Arabidopsis. У Arabidopsis выключение генов DCL не вызывает серьезных нарушений развития. Рис и виноград также производят DCL, поскольку дисерный механизм является распространенной защитной стратегией многих организмов. У риса развились дополнительные функции для пяти производимых им DCL, и они играют более важную роль в функционировании и развитии, чем у Arabidopsis. Кроме того, паттерны экспрессии различаются между различными типами растительных клеток риса, в то время как экспрессия у Arabidopsis более однородна. На экспрессию DCL риса могут влиять биологические стрессовые условия, такие как засуха, засоление и холод. Следовательно, эти стрессоры могут снизить вирусную устойчивость растений. В отличие от Arabidopsis, потеря функции белков DCL вызывает дефекты развития у риса.