Введение

Подавление экспрессии генов – это экспериментальная техника, с помощью которой снижается уровень экспрессии одного или нескольких генов организма. Снижение экспрессии может достигаться как путем генетической модификации, так и обработкой реагентом, например, коротким олигонуклеотидом ДНК или РНК, имеющим последовательность, комплементарную гену или мРНК-транскрипту.

Противоположность временному выключению

Если ДНК организма генетически модифицирована, полученный организм называется "нокдаун-организмом". Если изменение экспрессии гена вызвано связыванием олигонуклеотида с мРНК или временным связыванием с геном, это приводит к временному изменению экспрессии гена, которое не модифицирует хромосомную ДНК, и результат называется "транзиторным нокдауном". Наиболее прямое применение транзиторных нокдаунов – это изучение гена, который был секвенирован, но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика. Исследователи делают выводы, сравнивая фенотип нокдауна с фенотипом организмов, в которых ген интереса функционирует нормально. Транзиторные нокдауны часто используются в биологии развития, поскольку олигонуклеотиды можно вводить в одноклеточные зиготы, и они будут присутствовать в дочерних клетках инъецированной клетки на протяжении всего эмбрионального развития. Термин "нокаун гена" впервые появился в литературе в 1994 году.

РНК-интерференция

РНК-интерференция (РНКi) – это способ подавления экспрессии генов посредством деградации мРНК. Подавление генов этим методом достигается путем введения в цитоплазму небольших двухцепочечных интерферирующих РНК (siRNA). Небольшие интерферирующие РНК могут образовываться внутри клетки или вводиться в клетку извне. После попадания в клетку экзогенные siRNA обрабатываются РНК-индуцированным комплексом глушения (RISC). siRNA комплементарна целевой мРНК, которую необходимо подавить, и RISC использует siRNA в качестве шаблона для поиска целевой мРНК. После локализации RISC на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой. РНКi широко используется в качестве лабораторного метода для генетического функционального анализа. В организмах, таких как *C. elegans* и *Drosophila melanogaster*, РНКi предоставляет быстрый и экономичный способ изучения функции генов. В исследованиях на *C. elegans* доступность таких инструментов, как библиотека siRNA Ahringer, позволяет лабораториям тестировать множество генов в различных экспериментальных условиях. Знания, полученные в результате экспериментального использования РНКi, могут быть полезны для выявления потенциальных терапевтических мишеней, разработки лекарственных препаратов или других применений. РНК-интерференция – это очень полезный исследовательский инструмент, позволяющий ученым проводить масштабные генетические скрининги для выявления мишеней для дальнейших исследований, связанных с определенным сигнальным путем, лекарственным препаратом или фенотипом.

CRISPRs

Другим способом подавления экзогенной ДНК, обнаруженным у прокариотов, является механизм, включающий локусы, называемые «кластеризованными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами», или CRISPR. Гены, ассоциированные с CRISPR (cas), кодируют клеточный аппарат, который разрезает экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляет их в локус повторов CRISPR. Когда эта область CRISPR ДНК экспрессируется клеткой, короткие РНК, производимые из экзогенных вставок ДНК, служат матрицей для других белков Cas, используемых для подавления этой же экзогенной последовательности. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве направляющих для подавления этих чужеродных ДНК при их присутствии в клетке. Это служит своего рода приобретенным иммунитетом, и этот процесс аналогичен механизму РНК-интерференции у прокариотов. Повторы CRISPR консервативны для многих видов и показали свою применимость в клетках человека, бактериях, *C. elegans*, данио-рерио и других организмах для эффективной манипуляции геномом. Универсальность CRISPR как исследовательского инструмента иллюстрируется многочисленными исследованиями, использующими его для создания организмов с измененным геномом.

Таленты

Другая технология, ставшая возможной благодаря манипулированию прокариотическими геномами, – это использование нуклеаз, подобных эффекторным активаторам транскрипции (TALEN), для нацеливания на конкретные гены. TALEN – это нуклеазы, обладающие двумя важными функциональными компонентами: доменом связывания ДНК и доменом расщепления ДНК. Домен связывания ДНК представляет собой последовательно-специфичную эффекторную последовательность, подобную активатору транскрипции, в то время как домен расщепления ДНК происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифичным. TALEN можно сконструировать таким образом, чтобы расщеплять последовательность, определяемую последовательностью эффекторной части активатора транскрипции в конструкции. После конструирования TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в целевой последовательности и расщепляет определенный участок. После расщепления целевой последовательности ДНК с помощью TALEN клетка использует механизм восстановления ДНК – нехомологичное соединение концов – для устранения разрыва. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может сделать кодируемый белок нефункциональным, поскольку этот механизм восстановления вносит ошибки в виде вставок или делеций в месте восстановления.

Коммерциализация

До сих пор организмы с постоянными изменениями в ДНК создавались главным образом для исследовательских целей. Эти организмы, также известные просто как нокдауны, наиболее часто используются в обратной генетике, особенно у таких видов, как мыши или крысы, для которых технологии временного нокдауна сложно применить. Существует несколько компаний, предлагающих коммерческие услуги, связанные с обработкой для подавления экспрессии генов.