Масс-спектрометрия: основы и применение.

Введение

Инструмент химического анализа

Масс-спектр – это гистограмма, отображающая зависимость интенсивности от отношения массы к заряду (m/z) в химическом образце, обычно получаемая с помощью прибора, называемого масс-спектрометром. Масс-спектры одного и того же вещества могут различаться; например, некоторые масс-спектрометры расщепляют молекулы аналита на фрагменты, а другие наблюдают неповрежденные молекулярные массы с незначительной фрагментацией. Масс-спектр может содержать различные типы информации в зависимости от типа масс-спектрометра и конкретного эксперимента. Распространенными процессами фрагментации органических молекул являются перегруппировка Маклафферти и альфа-расщепление. Прямоцепочечные алканы и алкильные группы образуют типичный ряд пиков: 29 (CH3CH2+), 43 (CH3CH2CH2+), 57 (CH3CH2CH2CH2+), 71 (CH3CH2CH2CH2CH2+) и т.д.

Ось X: m/z (соотношение массы к заряду)

Ось x масс-спектра отражает соотношение между массой иона и числом элементарных зарядов, которые он несет. Это соотношение записывается в виде стандарта IUPAC m/z, обозначающего величину, полученную делением массы иона (в дальтонах) на атомную единицу массы и на абсолютную величину его заряда. Таким образом, m/z – это безразмерная величина, не имеющая единиц измерения. В соответствии с этой условностью, ось x масс-спектров может быть обозначена как m/z (Th), а отрицательные ионы будут иметь отрицательные значения. Однако такая нотация встречается редко и не одобрена IUPAC или другими организациями по стандартизации.

История обозначения оси х

В 1897 году отношение массы к заряду электрона впервые было измерено Дж. Дж. Томсоном. С помощью этого он показал, что электрон, существование которого ранее постулировалось для объяснения электричества, на самом деле является частицей, обладающей массой и зарядом, и что его отношение массы к заряду значительно меньше, чем у иона водорода H+. В 1913 году он измерил отношение массы к заряду ионов с помощью прибора, который он назвал параболическим спектрографом. Хотя эти данные не представлялись в виде современного масс-спектра, они имели схожий смысл. В конечном итоге обозначение m/e было заменено текущим стандартом m/z. На ранних этапах исследований в области масс-спектрометрии разрешение масс-спектрометров не позволяло проводить точное определение массы. Фрэнсис Уильям Астон получил Нобелевскую премию по химии в 1922 году «За открытие с помощью своего масс-спектрографа изотопов в большом количестве нерадиоактивных элементов и за формулировку правила целых чисел», в котором он утверждал, что все атомы (включая изотопы) подчиняются правилу целых чисел. Это подразумевало, что массы атомов не представляли собой непрерывную шкалу, а могли быть выражены целыми числами (фактически, многозарядные ионы были редки, поэтому в большинстве случаев отношение также было целым числом). Было сделано несколько предложений (например, использование единицы Томсона) об изменении официальной номенклатуры масс-спектрометрии для обеспечения большей внутренней согласованности.

Осе Y: интенсивность сигнала

Ось Y масс-спектра представляет собой интенсивность сигнала ионов. При использовании счетных детекторов интенсивность часто измеряется в количестве отсчетов в секунду (сп). При использовании аналоговой электронной аппаратуры для детектирования интенсивность обычно измеряется в вольтах. В FTICR и Orbitrap сигнал в частотной области (ось Y) связан с мощностью (~ квадратом амплитуды) синусоидальной волны сигнала (часто приводится к среднеквадратичной мощности), однако ось обычно не обозначается таким образом по ряду причин. В большинстве видов масс-спектрометрии интенсивность ионного тока, измеряемая спектрометром, неточно отражает относительное содержание, но слабо с ним коррелирует. Поэтому ось Y обычно обозначается как "условные единицы".

Осе Y и относительная распространенность

Интенсивность сигнала может зависеть от множества факторов, особенно от природы анализируемых молекул и способа их ионизации. Эффективность ионизации варьируется от молекулы к молекуле и от источника ионов к источнику ионов. Например, в источниках электрораспыления в режиме положительных ионов четвертичный амин ионизируется исключительно хорошо, в то время как большая гидрофобная спиртовая молекула, скорее всего, не будет обнаружена, независимо от её концентрации. В источнике EI эти молекулы будут вести себя совершенно иначе. Кроме того, существуют факторы, которые могут непропорционально влиять на передачу ионов между стадиями ионизации и детектирования. Со стороны детектирования также существует множество факторов, способных непропорционально влиять на интенсивность сигнала. Размер иона влияет на скорость его столкновения, а в некоторых детекторах скорость пропорциональна выходному сигналу. В других системах детектирования, таких как FTICR, количество зарядов на ионе играет более важную роль в определении интенсивности сигнала. В масс-спектрометрах с преобразованием Фурье ионного циклотронного резонанса и типа Orbitrap интенсивность сигнала (ось Y) связана с амплитудой сигнала свободного затухания. Это фундаментально степенная зависимость (амплитуда в квадрате), но часто вычисляется как [rms]. Для затухающих сигналов среднеквадратичное отклонение (rms) не равно средней амплитуде. Кроме того, постоянная затухания (скорость затухания сигнала в области свободного затухания) различна для разных ионов. Для получения выводов об относительной интенсивности требуется обширный объем знаний и тщательность. Распространенный способ получения более количественной информации из масс-спектра – построение калибровочной кривой для сравнения с образцом. Это требует предварительного знания того, что необходимо количественно определить, наличия стандарта и проектирования эксперимента специально для этой цели. Более продвинутым вариантом является использование внутреннего стандарта, поведение которого очень близко к поведению аналита. Часто это изотопно-меченый аналог аналита. Существуют методы масс-спектрометрии, такие как ускорительная масс-спектрометрия, которые изначально разрабатывались для количественного анализа.

Signal intensity may be dependent on many factors, especially the nature of the molecules being analyzed and how they ionize. The efficiency of ionization varies from molecule to molecule and from ion source to ion source. For example, in electrospray sources in positive ion mode a quaternary amine will ionize exceptionally well whereas a large hydrophobic alcohol will most likely not be seen no matter how concentrated. In an EI source these molecules will behave very differently. Additionally there may be factors that affect ion transmission disproportionally between ionization and detection. On the detection side there are many factors that can also affect signal intensity in a non proportional way. The size of the ion will affect the velocity of impact and with certain detectors the velocity is proportional to the signal output. In other detection systems, such as FTICR, the number of charges on the ion are more important to signal intensity. In Fourier transform ion cyclotron resonance and Orbitrap type mass spectrometers the signal intensity (Y axis) is related to the amplitude of the free induction decay signal. This is fundamentally a power relationship (amplitude squared) but often computed as an [rms]. For decaying signals the rms is not equal to the average amplitude. Additionally the damping constant (decay rate of the signal in the fid) is not the same for all ions. In order to make conclusions about relative intensity a great deal of knowledge and care is required. A common way to get more quantitative information out of a mass spectrum is to create a standard curve to compare the sample to. This requires knowing what is to be quantitated ahead of time, having a standard available and designing the experiment specifically for this purpose. A more advanced variation on this is the use of an internal standard which behaves very similarly to the analyte. This is often an isotopically labeled version of the analyte. There are forms of mass spectrometry, such as accelerator mass spectrometry that are designed from the bottom up to be quantitative.

Спектральная искривленность

Спектральное искажение — это изменение относительной интенсивности масс-спектральных пиков, вызванное изменением концентрации аналита в источнике ионов во время сканирования масс-спектра. Эта ситуация обычно возникает при элюировании хроматографических компонентов в непрерывный источник ионов. Спектральное искажение не наблюдается в ионных ловушках (четырехполюсных (такое наблюдалось также в QMS) или магнитных) или масс-анализаторах с временем пролета (TOF), поскольку потенциально все ионы, образованные в течение операционного цикла (мгновенного снимка) прибора, доступны для детектирования.