Введение

Мутация, сдвигающая выравнивание кодонов

Мутация сдвига рамки считывания (также называемая ошибкой рамки считывания или сдвигом рамки) – это генетическая мутация, вызванная вставками или делециями числа нуклеотидов в последовательности ДНК, не кратного трем. Вследствие триплетной природы экспрессии генов кодонами, вставка или делеция может изменить рамку считывания (группировку кодонов), приводя к совершенно иному трансляционному продукту по сравнению с исходным. Чем раньше в последовательности происходит делеция или вставка, тем сильнее изменяется белок. Мутация сдвига рамки считывания отличается от однонуклеотидного полиморфизма, при котором нуклеотид заменяется, а не вставляется или удаляется. Мутация сдвига рамки считывания, как правило, приводит к тому, что кодоны после мутации кодируют другие аминокислоты. Мутация сдвига рамки считывания также изменяет первый стоп-кодон ("UAA", "UGA" или "UAG"), встречающийся в последовательности. Создаваемый полипептид может быть аномально коротким или аномально длинным и, скорее всего, не будет функциональным. Мутации сдвига рамки считывания проявляются при тяжелых генетических заболеваниях, таких как болезнь Тея-Сакса; они повышают восприимчивость к определенным видам рака и семейным формам гиперхолестеринемии; в 1997 году мутация сдвига рамки считывания была связана с устойчивостью к заражению ретровирусом ВИЧ. Мутации сдвига рамки считывания были предложены в качестве источника биологической новизны, как в случае предполагаемого создания нейлоназы, однако эта интерпретация является дискуссионной. Исследование, проведенное Негоро и др. (2006), показало, что маловероятно, что мутация сдвига рамки считывания была причиной, и что скорее замена двух аминокислот в активном центре предковой эстеразы привела к образованию нейлоназы.

Предыстория

Информация, содержащаяся в ДНК, определяет функцию белков во всех клетках организмов. Транскрипция и трансляция обеспечивают реализацию этой информации в синтезе белков. Однако ошибка при считывании этой информации может привести к нарушению функции белка и, в конечном итоге, к развитию заболевания, даже несмотря на то, что клетка использует различные механизмы коррекции. Генетическая информация, закодированная в ДНК, служит для синтеза белков внутри клеток. Неправильная интерпретация этой информации может привести к дефектной функции и болезни, несмотря на наличие клеточных механизмов коррекции.

Центральная догма

В 1956 году Фрэнсис Крик описал поток генетической информации от ДНК к определенной аминокислотной последовательности для синтеза белка как центральную догму. Существует несколько биологических процессов, которые помогают предотвратить мутации со сдвигом рамки считывания. Происходят обратные мутации, которые восстанавливают мутировавшую последовательность до исходной, дикого типа. Другой способ коррекции мутации – использование супрессорной мутации. Она компенсирует эффект исходной мутации, создавая вторичную мутацию, которая сдвигает последовательность, позволяя считывать правильные аминокислоты. Направляющая РНК также может использоваться для вставки или удаления уридина в мРНК после транскрипции, что позволяет установить правильную рамку считывания. Кодоны играют ключевую роль в трансляции генетической информации для синтеза белков. Рамка считывания устанавливается в начале трансляции мРНК и сохраняется при последовательном считывании триплетов. Считывание генетического кода подчиняется трем правилам, регулирующим кодоны в мРНК. Во-первых, кодоны считываются в направлении 5'–3'. Во-вторых, кодоны не перекрываются, и в последовательности нет пробелов. И, наконец, сообщение транслируется в фиксированной рамке считывания.

Флуоресценция

Эффекты соседних оснований и вторичной структуры для выявления частоты мутаций сдвига рамки прочтения были детально исследованы с использованием флуоресценции. Флуоресцентно меченая ДНК, полученная с помощью аналогов оснований, позволяет изучать локальные изменения последовательности ДНК. Исследования влияния длины праймерной цепи показали, что наблюдается равновесная смесь четырех конформаций гибридизации, когда основания матрицы образуют выпячивание – структуру, с обеих сторон которой располагается двухцепочечная ДНК. Напротив, при расположении выступающих оснований в области соединения праймера и матрицы наблюдалась структура с двойной петлей и необычной некомпактной конформацией ДНК на ее конце, что демонстрирует, что несовпадения могут изменяться под влиянием соседней вторичной структуры ДНК.

Секвенирование

Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование – два метода, которые использовались для выявления мутаций со сдвигом рамки считывания, однако полученные данные, вероятно, не будут отличаться наивысшим качеством. Тем не менее, с помощью секвенирования по Сэнгеру было идентифицировано 1,96 миллиона инделей, которые не совпадают с данными других баз данных. При обнаружении мутации со сдвигом рамки считывания ее сравнивают с Базой данных мутаций генома человека (HGMD), чтобы определить, оказывает ли мутация повреждающее воздействие. Это делается путем оценки четырех признаков: во-первых, соотношения между измененным и консервативным участками ДНК; во-вторых, положения мутации относительно транскрипта; в-третьих, соотношения между консервативными и измененными аминокислотами; и, наконец, расстояния от инделя до конца экзона. При диагностике различных карцином современные методы позволяют анализировать только один ген за раз. Массивно-параллельное секвенирование позволяет одновременно выявлять различные мутации, вызывающие рак, в отличие от нескольких специфических тестов. Эксперимент, проведенный для оценки точности этого нового метода секвенирования, охватил 21 ген и не выявил ложноположительных результатов для мутаций со сдвигом рамки считывания.

Диагноз

Патент США (5 958 684) 1999 года, полученный Лиувеном, описывает методы и реагенты для диагностики заболеваний, вызванных или связанных с геном, несущим соматическую мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания. Методы включают получение образца ткани или жидкости и проведение анализа гена для выявления мутации сдвига рамки или белка, являющегося продуктом этой мутации. Нуклеотидная последовательность предполагаемого гена может быть получена из опубликованных баз данных генов или путем клонирования и секвенирования этого гена. Затем предсказывается аминокислотная последовательность, кодируемая геном. Секвенирование нуклеиновых кислот: для прямого секвенирования ДНК и выявления вставок или делеций можно использовать секвенирование по Сэнгеру или секвенирование нового поколения (NGS). Полимеразная цепная реакция (ПЦР): ПЦР может быть использована для амплификации специфического участка, содержащего мутацию, для последующего анализа. Мультиплексное амплифицирование зондов, зависящее от лигазы (MLPA): MLPA – это метод, используемый для обнаружения вариаций числа копий и небольших вставок или делеций. Сравнительная геномная гибридизация (СГГ): СГГ используется для выявления хромосомных дисбалансов, которые могут включать крупные вставки или делеции.

Частота

Несмотря на правила, регулирующие генетический код, и различные механизмы, присутствующие в клетке для обеспечения корректной передачи генетической информации в процессе репликации ДНК, а также при трансляции, мутации всё же возникают; мутация со сдвигом рамки считывания – не единственный тип. Существуют как минимум два других типа известных точечных мутаций, а именно – мутации, приводящие к замене аминокислоты (миссенс-мутации), и мутации, вызывающие преждевременный стоп-кодон (нонсенс-мутации). Мутации со сдвигом рамки считывания чаще встречаются в повторяющихся участках ДНК. Это связано с тем, что в повторяющихся участках фермент полимераза может "скользить", что приводит к включению мутаций в последовательность. Для определения частоты мутаций со сдвигом рамки считывания можно проводить эксперименты, добавляя или удаляя заранее заданное количество нуклеотидов. Эксперименты проводились с добавлением четырех пар оснований (так называемые эксперименты "+4"), однако группа исследователей из Университета Эмори изучила разницу в частоте мутаций при добавлении и удалении одной пары оснований. Было показано, что частота мутаций при добавлении и удалении пары оснований не различается. Однако, результат воздействия на белок различается.

Болезни

Некоторые заболевания имеют мутации со сдвигом рамки считывания как минимум в качестве одной из причин. Знание распространенных мутаций также может способствовать диагностике заболевания. В настоящее время предпринимаются попытки использовать мутации со сдвигом рамки считывания с терапевтической целью, изменяя рамку считывания аминокислот.

Рак

Известно, что мутации со сдвигом рамки считывания играют роль в развитии колоректального рака, а также других видов рака с микросателлитной нестабильностью. Как уже было сказано, мутации со сдвигом рамки считывания чаще возникают в регионах повторяющихся последовательностей. Если система репарации неспаренных оснований ДНК не исправляет добавление или удаление оснований, эти мутации с большей вероятностью будут патогенными. Это может быть частично связано с тем, что опухоль не получает сигнал к остановке роста. Эксперименты на дрожжах и бактериях помогают выявить характеристики микросателлитов, которые могут способствовать дефектной репарации неспаренных оснований ДНК. К ним относятся длина микросателлита, состав генетического материала и степень чистоты повторов. Экспериментальные данные показывают, что более длинные микросателлиты имеют более высокую частоту мутаций со сдвигом рамки считывания. Окружающая ДНК также может способствовать возникновению таких мутаций. При раке предстательной железы мутация со сдвигом рамки считывания изменяет открытую рамку считывания (ORF) и препятствует апоптозу. Это приводит к неконтролируемому росту опухоли. Хотя факторы окружающей среды вносят вклад в прогрессирование рака предстательной железы, существует и генетическая предрасположенность. При исследовании кодирующих областей для выявления мутаций было обнаружено 116 генетических вариантов, включая 61 мутацию со сдвигом рамки считывания. В гене BRCA1 на хромосоме 17 обнаружено более 500 мутаций, которые, по-видимому, играют роль в развитии рака молочной железы и яичников, многие из которых являются мутациями со сдвигом рамки считывания.

Болезнь Крона

Болезнь Крона ассоциирована с геном NOD2. Мутация заключается во вставке цитозина в позиции 3020. Это приводит к образованию преждевременного стоп-кодона, что укорачивает синтезируемый белок. В случае нормального формирования белка, он реагирует на бактериальные липосахариды, однако мутация 3020insC блокирует эту реакцию.

Кистозный фиброз

Кистозный фиброз (КФ) – это заболевание, обусловленное мутациями в гене трансмембранного регулятора проводимости при кистозном фиброзе (CFTR). Известно более 1500 мутаций, однако не все из них вызывают заболевание. В большинстве случаев кистозный фиброз является результатом мутации ∆F508, приводящей к делеции аминокислоты. Две мутации со сдвигом рамки считывания представляют интерес при диагностике КФ: CF1213delT и CF1154insTC. Обе эти мутации обычно встречаются в сочетании как минимум с одной другой мутацией. Они обе приводят к незначительному снижению функции легких и выявляются примерно у 1% обследованных пациентов. Эти мутации были идентифицированы методом секвенирования по Сэнгеру.

ВИЧ

CCR5 является одним из кофакторов проникновения в клетки, связанных с ВИЧ, наиболее часто встречающимся при несинцитий-индуцирующих штаммах, и наиболее выражен у пациентов с ВИЧ, а не у пациентов со СПИДом. Делеция 32 пар оснований в CCR5 была идентифицирована как мутация, снижающая вероятность заражения ВИЧ. Этот участок в открытой рамке считывания ORF содержит мутацию со сдвигом рамки, приводящую к преждевременному стоп-кодону. Это приводит к потере функции корецептора ВИЧ in vitro. CCR5 1 считается диким типом, а CCR5 2 – мутантным аллелем. Люди с гетерозиготной мутацией CCR5 были менее восприимчивы к развитию ВИЧ. В одном исследовании, несмотря на высокую экспозицию к вирусу ВИЧ, ни у одного гомозиготного носителя мутации CCR5 не было выявлено положительного результата на ВИЧ. Известно, что мутации в гене β-гексозаминидазы А (Hex A) влияют на развитие болезни Тея-Сакса, при этом описано 78 мутаций различных типов, 67 из которых вызывают заболевание. Большинство наблюдаемых мутаций (65/78) – это однонуклеотидные замены или SNP, 11 делеций, 1 крупная и 10 мелких, и 2 вставки. 8 из наблюдаемых мутаций – это мутации со сдвигом рамки, 6 – делеции и 2 – вставки. Вставка 4 пар оснований в экзоне 11 наблюдается в 80% случаев болезни Тея-Сакса у евреев-ашкеназов. Мутации со сдвигом рамки приводят к раннему стоп-кодону, который играет роль в развитии заболевания у младенцев. Отсроченное начало заболевания, по-видимому, вызвано 4 различными мутациями, одна из которых – делеция 3 пар оснований.

Синдром Смита и Магениса

Синдром Смита-Магениса (СМС) – это комплексный синдром, включающий интеллектуальные нарушения, нарушения сна, поведенческие проблемы и разнообразные черепно-лицевые, скелетные и висцеральные аномалии. В большинстве случаев СМС наблюдается общая делеция размером около 3,5 Мб, охватывающая ген RAI1, индуцированный ретиноевой кислотой. Другие случаи демонстрируют вариабельность фенотипа СМС, не ранее связанную с мутациями в гене RAI1, включая потерю слуха, отсутствие аутоагрессивного поведения и умеренные общие задержки развития. Секвенирование RAI1 выявило мутацию гептамерного участка (CCCCCCC) в экзоне 3, приводящую к мутациям со сдвигом рамки считывания. Из семи зарегистрированных мутаций со сдвигом рамки считывания, возникающих в поли-C участках гена RAI1, четыре случая (~57%) приходятся на этот гептамерный C участок. Полученные результаты указывают на то, что этот гептамерный C участок является предпочтительной точкой рекомбинации, приводящей к вставкам/делециям (SNindels), и, следовательно, является основной целью анализа у пациентов с подозрением на мутации в гене RAI1.

Гипертрофическая кардиомиопатия

Гипертрофическая кардиомиопатия является наиболее частой причиной внезапной смерти у молодых людей, включая подготовленных спортсменов, и обусловлена мутациями в генах, кодирующих белки сердечного саркомера. Мутации в гене тропонина C (TNNC1) – редкая генетическая причина гипертрофической кардиомиопатии. Недавнее исследование показало, что мутация со сдвигом рамки считывания (c.363dupG или p. Gln122AlafsX30) в гене тропонина C явилась причиной гипертрофической кардиомиопатии (и внезапной сердечной смерти) у 19-летнего юноши.

Лекарства

Найти лекарство от болезней, вызванных мутациями со сдвигом рамки чтения, – редкость. Исследования в этой области продолжаются. Одним из примеров является первичный иммунодефицит (ПИД) – наследственное заболевание, которое может приводить к увеличению восприимчивости к инфекциям. В развитии первичных иммунодефицитов участвуют 120 генов и 150 мутаций. В настоящее время стандартным методом лечения является генная терапия, однако это высокорискованная процедура, которая часто может приводить к другим заболеваниям, таким как лейкемия. Методы генной терапии включают модификацию белка – цинкового пальцевого нуклеазы, расщепление концов мутации, что, в свою очередь, удаляет ее из последовательности. Пропуск экзонов, опосредованный антисмысловыми олигонуклеотидами, – еще одна возможность при дистрофии Дюшенна. Этот процесс позволяет «перескакивать» через мутацию, сохраняя рамку чтения в остальной части последовательности и обеспечивая сохранность функции белка. Однако это не излечивает заболевание, а лишь облегчает симптомы и эффективно только для структурных белков или других повторяющихся генов. Третий механизм восстановления – ревертантный мозаицизм, который возникает естественным путем за счет обратной мутации или мутации в другом участке, корректирующей рамку чтения. Реверсия может происходить посредством внутригенной рекомбинации, митотической конверсии генов, сдвига ДНК во втором участке или сайт-специфической реверсии. Это возможно при ряде заболеваний, таких как Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит (СКИД), синдром Вискотта-Алдриха и синдром Блума. Лекарств или других фармакогеномных методов лечения ПИД не существует. Европейский патент (EP1369126A1), зарегистрированный в 2003 году Борком, описывает метод, используемый для профилактики рака и лечения раковых и предраковых заболеваний, таких как спорадические опухоли с дефицитом системы репарации ДНК (MMR) и опухоли, связанные с HNPCC. Суть метода заключается в использовании иммунотерапии с комбинациями пептидов, полученных из мутаций со сдвигом рамки чтения, специфичных для опухоли, для стимуляции цитотоксического Т-клеточного ответа, направленного конкретно против опухолевых клеток.