Тест Эймса на мутагенность химических веществ.

Введение

Метод биологического тестирования – тест химических веществ на мутагенность.

Тест Эймса – это широко используемый метод, использующий бактерии для определения способности химического вещества вызывать мутации в ДНК тестового организма. В более строгом определении, это биологическое исследование для оценки мутагенного потенциала химических соединений. Положительный результат указывает на то, что химическое вещество является мутагенным и, следовательно, может выступать в качестве канцерогена, поскольку рак часто связан с мутациями. Тест служит быстрым и удобным методом оценки канцерогенного потенциала соединения, поскольку стандартные исследования канцерогенности на мышах и крысах занимают много времени (от двух до трех лет) и являются дорогостоящими. Однако известны случаи ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Процедура была описана в серии статей в начале 1970-х годов Брюсом Эймсом и его группой из Калифорнийского университета в Беркли. Тестовые штаммы также несут мутации в генах, ответственных за синтез липополисахаридов, что делает клеточную стенку бактерий более проницаемой, и в системе эксцизионной репарации, чтобы повысить чувствительность теста. Более крупные организмы, такие как млекопитающие, обладают метаболическими процессами, которые потенциально могут превратить химическое вещество, считающееся немутагенным, в мутагенное, или наоборот. Поэтому, для более эффективной оценки мутагенности химического соединения в отношении более крупных организмов, в тест Эймса могут быть добавлены ферменты печени крыс, чтобы имитировать влияние метаболических процессов на исследуемое соединение. Экстракт печени крыс опционально добавляется для имитации эффекта метаболизма, поскольку некоторые соединения, такие как бензо[а]пирен, сами по себе не являются мутагенными, но их метаболические продукты обладают мутагенностью. Бактерии распределяют на агаровой пластинке с небольшим количеством гистидина. Это небольшое количество гистидина в питательной среде позволяет бактериям расти в течение начального периода времени и получить возможность мутировать. Когда гистидин истощается, выживают только бактерии, которые мутировали и приобрели способность производить собственный гистидин. Плитка инкубируется в течение 48 часов. Мутагенность вещества пропорциональна количеству образовавшихся колоний.

The Ames test is a widely employed method that uses bacteria to test whether a given chemical can cause mutations in the DNA of the test organism. More formally, it is a biological assay to assess the mutagenic potential of chemical compounds. A positive test indicates that the chemical is mutagenic and therefore may act as a carcinogen, because cancer is often linked to mutation. The test serves as a quick and convenient assay to estimate the carcinogenic potential of a compound because standard carcinogen assays on mice and rats are time consuming (taking two to three years to complete) and expensive. However, false positives and false negatives are known. The procedure was described in a series of papers in the early 1970s by Bruce Ames and his group at the University of California, Berkeley. The tester strains also carry mutations in the genes responsible for lipopolysaccharide synthesis, making the cell wall of the bacteria more permeable, and in the excision repair system to make the test more sensitive. Larger organisms like mammals have metabolic processes that could potentially turn a chemical considered not mutagenic into one that is or one that is considered mutagenic into one that is not. Therefore, to more effectively test a chemical compound's mutagenicity in relation to larger organisms, rat liver enzymes can be added in an attempt to replicate the metabolic processes' effect on the compound being tested in the Ames Test. Rat liver extract is optionally added to simulate the effect of metabolism, as some compounds, like benzo[a]pyrene, are not mutagenic themselves but their metabolic products are. The bacteria are spread on an agar plate with small amount of histidine. This small amount of histidine in the growth medium allows the bacteria to grow for an initial time and have the opportunity to mutate. When the histidine is depleted only bacteria that have mutated to gain the ability to produce its own histidine will survive. The plate is incubated for 48 hours. The mutagenicity of a substance is proportional to the number of colonies observed.

Тест Амеса и канцерогены

Мутагены, выявленные с помощью теста Эймса, также являются потенциальными канцерогенами, и ранние исследования, проведенные Эймсом, показали, что 90% известных канцерогенов могут быть идентифицированы с его помощью. Однако более поздние исследования продемонстрировали возможность идентификации 50–70% известных канцерогенов. Тест использовался для выявления ряда соединений, ранее применяемых в коммерческих продуктах, как потенциальных канцерогенов. Примеры включают трис(2,3-дибромопропил)фосфат, который использовался в качестве антипирена в пластмассах и текстиле, например, в детской пижаме, и фурилфурамид, который применялся в качестве антибактериальной добавки в пищевых продуктах в Японии в 1960-х и 1970-х годах. Фурилфурамид, фактически, ранее успешно прошел тесты на животных, но более строгие исследования после его обнаружения в тесте Эймса подтвердили его канцерогенность. Положительные результаты этих тестов привели к изъятию этих химических веществ из потребительских товаров. Интересным результатом теста Эймса является то, что кривая «доза-реакция» при использовании различных концентраций химического вещества почти всегда линейна. Тем не менее, некоторые предполагают, что организмы могут переносить низкие уровни мутагенов благодаря защитным механизмам, таким как восстановление ДНК, и, следовательно, для определенных химических мутагенов может существовать пороговый уровень. Сам Брюс Эймс возражал против линейной экстраполяции дозового ответа от высоких доз, используемых в тестах канцерогенеза на животных, к более низким дозам химических веществ, обычно встречающимся при воздействии на человека, поскольку результаты могут быть ложноположительными из-за митогенного ответа, вызванного искусственно высокой дозой химических веществ, используемых в таких тестах. Он также предостерегал от «истерии по поводу незначительных следов химических веществ, которые могут или не могут вызывать рак», которая «полностью вытесняет основные риски, о которых следует знать». Тест Эймса часто используется в качестве одного из первичных скринингов потенциальных лекарственных препаратов для исключения возможных канцерогенов, и он входит в число восьми тестов, требуемых в соответствии с Законом о пестицидах (США), и в число шести тестов, требуемых в соответствии с Законом о контроле за токсичными веществами (США).

Ограничения

Salmonella typhimurium является прокариотом, поэтому не является идеальной моделью для человека. Фракция печени крыс S9 используется для имитации метаболических условий млекопитающих, чтобы можно было оценить мутагенный потенциал метаболитов, образующихся из исходной молекулы в печени; однако существуют различия в метаболизме между человеком и крысами, которые могут повлиять на мутагенность тестируемых химических веществ. Поэтому тест можно улучшить, используя фракцию печени человека S9; ранее ее использование было ограничено доступностью, но теперь она доступна в продаже и, следовательно, может быть более целесообразной. Для эукариотических клеток, например дрожжей, была разработана адаптированная модель in vitro. Мутагены, выявленные в тесте Эймса, не обязательно являются канцерогенными, и для любого потенциального канцерогена, обнаруженного в тесте, требуются дальнейшие исследования. Препараты, содержащие нитратную группу, иногда дают положительный результат в тесте Эймса, хотя на самом деле они безопасны. Нитратные соединения могут образовывать оксид азота – важную сигнальную молекулу, которая может давать ложноположительный результат. Нитроглицерин – пример вещества, дающего положительный результат в тесте Эймса, но при этом продолжающего использоваться в лечении. Однако нитраты в пище могут восстанавливаться бактериями до нитритов, которые, как известно, образуют канцерогены, реагируя с аминами и амидами. Для опровержения положительного результата теста Эймса с такими соединениями необходимы длительные токсикологические исследования и изучение результатов их применения.

Метод колебаний

Испытание Амеса было первоначально разработано с использованием агарных пластин (техника внесения в агар), как описано выше. С тех пор была разработана альтернатива проведению теста Амеса, известная как "флуктуационный метод". Этот метод концептуально аналогичен методу на основе агара, при котором бактерии добавляются в реакционную смесь с небольшим количеством гистидина, что позволяет им расти и мутировать, восстанавливая способность синтезировать собственный гистидин. Добавление индикатора pH позволяет подсчитывать частоту мутаций в микропланшетах как количество лунок, изменивших цвет (из-за снижения pH в результате метаболических процессов размножающихся бактерий). Как и в традиционном тесте Амеса, образец сравнивается с естественным уровнем обратной мутации, чтобы установить генотоксичность вещества. Флуктуационный метод выполняется полностью в жидкой культуре, а оценка проводится путем подсчета количества лунок, изменивших цвет с фиолетового на желтый в микропланшетах с 96 или 384 лунками. В методе с 96-луночными планшетами частота мутаций рассчитывается как количество лунок из 96, изменивших цвет. Планшеты инкубируют до пяти дней, ежедневно подсчитывая количество мутировавших (желтых) колоний и сравнивая их с фоновым уровнем обратной мутации, используя установленные таблицы значимости для определения существенных различий между фоновым уровнем мутаций и уровнем для исследуемых образцов. В более компактном методе микрофлуктуации с 384 лунками частота мутаций рассчитывается как количество лунок из 48, изменивших цвет после 2 дней инкубации. Испытуемый образец анализируется на 6 уровнях дозы с одновременным контролем нулевой дозы (фон) и положительным контролем, которые помещаются в одну 384-луночную планшету. Анализ проводится в трех повторностях для обеспечения статистической достоверности. Используются рекомендованные Руководством ОЭСР 471 тестовые штаммы (ауксотрофы по гистидину и ауксотрофы по триптофану). Флуктуационный метод сопоставим с традиционным методом выливания на агар по чувствительности и точности, однако он имеет ряд преимуществ: требуется меньше образца для анализа, используется простая колориметрическая конечная точка, подсчет количества положительных лунок из возможных 96 или 48 занимает гораздо меньше времени, чем подсчет отдельных колоний на агарной пластине. Доступно несколько коммерческих наборов. Большинство наборов содержат готовые к использованию компоненты, включая лиофилизированные бактерии, и тесты могут выполняться с использованием многоканальных пипеток. Флуктуационный метод также позволяет тестировать большие объемы водных образцов (до 75% по объему), повышая чувствительность и расширяя его применение для мутагенов окружающей среды с низким уровнем воздействия.

The Ames test was initially developed using agar plates (the plate incorporation technique), as described above. Since that time, an alternative to performing the Ames test has been developed, which is known as the "fluctuation method". This technique is the same in concept as the agar based method, with bacteria being added to a reaction mixture with a small amount of histidine, which allows the bacteria to grow and mutate, returning to synthesize their own histidine. By including a pH indicator, the frequency of mutation is counted in microplates as the number of wells which have changed color (caused by a drop in pH due to metabolic processes of reproducing bacteria). As with the traditional Ames test, the sample is compared to the natural background rate of reverse mutation in order to establish the genotoxicity of a substance. The fluctuation method is performed entirely in liquid culture and is scored by counting the number of wells that turn yellow from purple in 96 well or 384 well microplates. In the 96 well plate method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 96 which have changed color. The plates are incubated for up to five days, with mutated (yellow) colonies being counted each day and compared to the background rate of reverse mutation using established tables of significance to determine the significant differences between the background rate of mutation and that for the tested samples. In the more scaled down 384 well plate microfluctuation method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 48 which have changed color after 2 days of incubation. A test sample is assayed across 6 dose levels with concurrent zero dose (background) and positive controls which all fit into one 384 well plate. The assay is performed in triplicates to provide statistical robustness. It uses the recommended OECD Guideline 471 tester strains (histidine auxotrophs and tryptophan auxotrophs). The fluctuation method is comparable to the traditional pour plate method in terms of sensitivity and accuracy, however, it does have a number of advantages: it needs less test sample, it has a simple colorimetric endpoint, counting the number of positive wells out of possible 96 or 48 wells is much less time consuming than counting individual colonies on an agar plate. Several commercial kits are available. Most kits have consumable components in a ready to use state, including lyophilized bacteria, and tests can be performed using multichannel pipettes. The fluctuation method also allows for testing higher volumes of aqueous samples (up to 75% v/v), increasing the sensitivity and extending its application to low level environmental mutagens.