Белок p53: роль в онкогенезе и полиморфизм гена TP53 у человека.

Введение

Белки млекопитающих, обнаруженные у человека (Homo sapiens).

p53, также известный как опухолевый белок P53, клеточный опухолевый антиген p53 (название в UniProt) или белок 53, связанный с трансформацией (TRP53), – это регуляторный белок, который часто мутирует при раке человека. Белки p53 (изначально считавшиеся и часто упоминаемые как единый белок) играют важнейшую роль у позвоночных, предотвращая развитие рака. В связи с этим p53 называют "хранителем генома" из-за его функции по поддержанию стабильности, предотвращая мутации генома. Следовательно, TP53 классифицируется как ген-супрессор опухоли. Помимо полноразмерного белка, ген TP53 человека кодирует как минимум 12 белковых изоформ.

Ген

У людей ген TP53 расположен на коротком плече хромосомы 17 (17p13.1). Ортологи TP53 были идентифицированы у большинства млекопитающих, для которых доступны полные данные генома.

Ген TP53 человека

У человека распространенный полиморфизм включает замену пролина на аргинин в кодоновой позиции 72 экзона 4. Многие исследования изучали генетическую связь между этой вариацией и восприимчивостью к раку, однако результаты были противоречивыми. Например, мета-анализ 2009 года не выявил связи с раком шейки матки. Исследование 2011 года показало, что мутация пролина в TP53 действительно оказывает значительное влияние на риск рака поджелудочной железы у мужчин. Исследование среди арабских женщин показало, что гомозиготность по пролину в кодоне 72 гена TP53 связана со снижением риска развития рака молочной железы. Одно исследование предположило, что полиморфизмы кодона 72 TP53, MDM2 SNP309 и A2164G могут в совокупности быть связаны с восприимчивостью к раку, не связанному с ротоглоточным раком, и что MDM2 SNP309 в сочетании с кодоном 72 TP53 может ускорить развитие рака, не связанного с ротоглоточным раком, у женщин. Исследование 2011 года показало, что полиморфизм кодона 72 TP53 связан с повышенным риском развития рака легких. Мета-анализы 2011 года не выявили значимых ассоциаций между полиморфизмом кодона 72 TP53 и риском развития колоректального рака и рака эндометрия. Исследование 2011 года бразильской когорты новорожденных выявило связь между немутантным аргинином TP53 и людьми без семейного анамнеза рака. Другое исследование 2011 года показало, что гомозиготный генотип p53 (Pro/Pro) связан со значительно повышенным риском развития почечно-клеточного рака.

Стволовые клетки

Уровни p53 играют важную роль в поддержании стволовых клеток на протяжении всего развития и в течение всей жизни человека. В человеческих эмбриональных стволовых клетках (hESC) p53 поддерживается на низком неактивном уровне. Это связано с тем, что активация p53 приводит к быстрой дифференцировке hESC. Исследования показали, что нокаутирование p53 задерживает дифференцировку, а добавление p53 вызывает спонтанную дифференцировку, демонстрируя, как p53 способствует дифференцировке hESC и играет ключевую роль в клеточном цикле как регулятор дифференцировки. Когда p53 стабилизируется и активируется в hESC, он повышает уровень p21, что приводит к удлинению фазы G1. Это обычно приводит к блокировке входа в фазу S, останавливая клеточный цикл в G1 и вызывая дифференцировку. Однако недавние исследования на мышиных эмбриональных стволовых клетках показали, что экспрессия P53 не обязательно приводит к дифференцировке. p53 также активирует miR-34a и miR-145, которые, в свою очередь, подавляют факторы плюрипотентности hESC, дополнительно стимулируя дифференцировку. Подавление p53 играет важную роль в фенотипе раковых стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и других функциях и поведении стволовых клеток, таких как формирование бластемы. Показано, что клетки с пониженным уровнем p53 перепрограммируются в стволовые клетки с гораздо большей эффективностью, чем нормальные клетки. В публикациях предполагается, что отсутствие ареста клеточного цикла и апоптоза дает большему числу клеток возможность перепрограммироваться. Снижение уровня p53 также было показано как важный аспект формирования бластемы в ногах саламандр. Регуляция p53 имеет решающее значение как барьер между стволовыми клетками и дифференцированным состоянием, а также как барьер между функциональными стволовыми клетками и раковыми клетками.

Другое

Помимо клеточных и молекулярных эффектов, описанных выше, p53 оказывает противораковое действие на уровне тканей, реализуемое посредством ингибирования ангиогенеза. Показано, что p53, регулируя ингибирующий фактор лейкемии, способствует имплантации у мышей и, возможно, у человека. Иммунный ответ на инфекцию также включает p53 и NF κB. Некоторые инфекции, такие как бактерии Mycoplasma, подавляют контрольные точки клеточного цикла и апоптоза, регулируемые p53, что создает риск онкогенной инфекции.

Регулирование

p53 действует как датчик клеточного стресса. Обычно его уровень поддерживается низким за счет постоянной маркировки для деградации E3 убиквитин-лигазой MDM2. p53 активируется в ответ на множество стрессовых факторов, включая повреждение ДНК (вызванное УФ-, ИК-излучением или химическими агентами, такими как перекись водорода), окислительный стресс, осмотический шок, истощение рибонуклеотидов, вирусные инфекции легких и дерегулированную экспрессию онкогенов. Эта активация характеризуется двумя основными событиями. Во-первых, период полураспада белка p53 резко увеличивается, что приводит к быстрому накоплению p53 в клетках, подвергшихся стрессу. Во-вторых, конформационное изменение заставляет p53 активироваться как регулятор транскрипции в этих клетках. Критическим событием, приводящим к активации p53, является фосфорилирование его N-концевого домена. N-концевой домен транскрипционной активации содержит большое количество сайтов фосфорилирования и может рассматриваться как основная мишень для протеинкиназ, передающих сигналы стресса. Протеинкиназы, известные своей направленностью на этот домен транскрипционной активации p53, можно условно разделить на две группы. Первая группа протеинкиназ принадлежит к семейству MAPK (JNK1-3, ERK1/2, p38 MAPK), которые, как известно, реагируют на различные типы стресса, такие как повреждение мембраны, окислительный стресс, осмотический шок, тепловой шок и т.д. Вторая группа протеинкиназ (ATR, ATM, CHK1 и CHK2, DNA PK, CAK, TP53RK) вовлечена в контрольную точку целостности генома – молекулярный каскад, который обнаруживает и реагирует на различные формы повреждения ДНК, вызванные генотоксическим стрессом. Онкогены также стимулируют активацию p53, опосредованную белком p14ARF. В не подвергшихся стрессу клетках уровень p53 поддерживается низким за счет непрерывной деградации p53. Белок под названием Mdm2 (также называемый HDM2 у человека) связывается с p53, предотвращая его действие и транспортируя его из ядра в цитозоль. Mdm2 также действует как убиквитин-лигаза и ковалентно присоединяет убиквитин к p53, тем самым маркируя p53 для деградации протеасомой. Однако убиквитинирование p53 обратимо. При активации p53 также активируется Mdm2, создавая петлю обратной связи. Уровень p53 может демонстрировать колебания (или повторяющиеся импульсы) в ответ на определенные стрессы, и эти импульсы могут быть важны для определения того, выживут ли клетки под воздействием стресса или погибнут. MI 63 связывается с MDM2, реактивируя p53 в ситуациях, когда функция p53 была ингибирована. Убиквитин-специфическая протеаза USP7 (или HAUSP) может отщеплять убиквитин от p53, тем самым защищая его от деградации, зависящей от протеасомы, посредством убиквитин-лигазного пути. Это один из способов стабилизации p53 в ответ на онкогенные воздействия. USP42 также показал способность деубиквитинировать p53 и может быть необходим для способности p53 реагировать на стресс. Недавние исследования показали, что HAUSP в основном локализуется в ядре, хотя его часть может быть обнаружена в цитоплазме и митохондриях. Избыточная экспрессия HAUSP приводит к стабилизации p53. Однако истощение HAUSP не приводит к снижению уровня p53, а скорее увеличивает его, поскольку HAUSP связывает и деубиквитинирует Mdm2. Показано, что HAUSP является лучшим партнером для связывания с Mdm2, чем p53 в нестрессовых клетках. USP10, однако, локализуется в цитоплазме в нестрессовых клетках и деубиквитинирует цитоплазматический p53, обращая вспять убиквитинирование Mdm2. После повреждения ДНК USP10 перемещается в ядро и способствует стабильности p53. Также USP10 не взаимодействует с Mdm2. Некоторые онкогены также могут стимулировать транскрипцию белков, которые связываются с MDM2 и ингибируют его активность.

p53 acts as a cellular stress sensor. It is normally kept at low levels by being constantly marked for degradation by the E3 ubiquitin ligase protein MDM2. p53 is activated in response to myriad stressors – including DNA damage (induced by either UV, IR, or chemical agents such as hydrogen peroxide), oxidative stress, osmotic shock, ribonucleotide depletion, viral lung infections and deregulated oncogene expression. This activation is marked by two major events. First, the half life of the p53 protein is increased drastically, leading to a quick accumulation of p53 in stressed cells. Second, a conformational change forces p53 to be activated as a transcription regulator in these cells. The critical event leading to the activation of p53 is the phosphorylation of its N terminal domain. The N terminal transcriptional activation domain contains a large number of phosphorylation sites and can be considered as the primary target for protein kinases transducing stress signals. The protein kinases that are known to target this transcriptional activation domain of p53 can be roughly divided into two groups. A first group of protein kinases belongs to the MAPK family (JNK1 3, ERK1 2, p38 MAPK), which is known to respond to several types of stress, such as membrane damage, oxidative stress, osmotic shock, heat shock, etc. A second group of protein kinases (ATR, ATM, CHK1 and CHK2, DNA PK, CAK, TP53RK) is implicated in the genome integrity checkpoint, a molecular cascade that detects and responds to several forms of DNA damage caused by genotoxic stress. Oncogenes also stimulate p53 activation, mediated by the protein p14ARF. In unstressed cells, p53 levels are kept low through a continuous degradation of p53. A protein called Mdm2 (also called HDM2 in humans), binds to p53, preventing its action and transports it from the nucleus to the cytosol. Mdm2 also acts as an ubiquitin ligase and covalently attaches ubiquitin to p53 and thus marks p53 for degradation by the proteasome. However, ubiquitylation of p53 is reversible. On activation of p53, Mdm2 is also activated, setting up a feedback loop. p53 levels can show oscillations (or repeated pulses) in response to certain stresses, and these pulses can be important in determining whether the cells survive the stress, or die. MI 63 binds to MDM2, reactivating p53 in situations where p53's function has become inhibited. A ubiquitin specific protease, USP7 (or HAUSP), can cleave ubiquitin off p53, thereby protecting it from proteasome dependent degradation via the ubiquitin ligase pathway. This is one means by which p53 is stabilized in response to oncogenic insults. USP42 has also been shown to deubiquitinate p53 and may be required for the ability of p53 to respond to stress. Recent research has shown that HAUSP is mainly localized in the nucleus, though a fraction of it can be found in the cytoplasm and mitochondria. Overexpression of HAUSP results in p53 stabilization. However, depletion of HAUSP does not result in a decrease in p53 levels but rather increases p53 levels due to the fact that HAUSP binds and deubiquitinates Mdm2. It has been shown that HAUSP is a better binding partner to Mdm2 than p53 in unstressed cells. USP10 however has been shown to be located in the cytoplasm in unstressed cells and deubiquitinates cytoplasmic p53, reversing Mdm2 ubiquitination. Following DNA damage, USP10 translocates to the nucleus and contributes to p53 stability. Also USP10 does not interact with Mdm2. Some oncogenes can also stimulate the transcription of proteins that bind to MDM2 and inhibit its activity.

Экспериментальный анализ мутаций p53

Большинство мутаций p53 обнаруживаются с помощью секвенирования ДНК. Однако известно, что отдельные миссенс-мутации могут иметь широкий спектр последствий – от умеренных до очень сильных – для функции белка. Мутация TP53 также влияет на энергетический метаболизм и усиливает гликолиз в клетках рака молочной железы. Динамика белков p53, наряду с его антагонистом Mdm2, показывает, что уровни p53, измеренные в единицах концентрации, осциллируют во времени. Эта "затухающая" осцилляция как клинически подтверждена, так и математически смоделирована. Математические модели также указывают на то, что концентрация p53 начинает осциллировать гораздо быстрее при введении в систему тератогенов, таких как двухцепочечные разрывы (DSB) или УФ-излучение. Это подтверждает и моделирует современное понимание динамики p53, согласно которому повреждение ДНК индуцирует активацию p53 (см. раздел "Регуляция p53" для получения дополнительной информации). Существующие модели также могут быть полезны для моделирования мутаций в изоформах p53 и их влияния на осцилляции p53, тем самым способствуя разработке новых тканеспецифичных фармакологических препаратов.

Открытие

p53 был идентифицирован в 1979 году Лионелем Кроуфордом, Дэвидом П. Лейном, Арнольдом Левином и Ллойдом Олдом, работавшими в Имперском фонде исследований рака (Великобритания), Принстонском университете/UMDNJ (Институте рака Нью-Джерси) и Мемориальном центре рака Слоан-Кеттеринг соответственно. Предполагалось, что он существовал и ранее как мишень вируса SV40, штамма, индуцирующего развитие опухолей. Название p53 было присвоено в 1979 году, отражая его предполагаемую молекулярную массу. Ген TP53 мыши был впервые клонирован Петром Чумаковым из Академии наук СССР в 1982 году, а независимо от него – в 1983 году Моше Ореном в сотрудничестве с Дэвидом Гиволом (Институт науки Вейцмана). Ген TP53 человека был клонирован в 1984 году.

Первоначально его считали онкогеном из-за использования мутировавшей кДНК после очистки мРНК опухолевых клеток. Его роль в качестве гена-супрессора опухоли была установлена в 1989 году Бертом Фогельштейном из Медицинской школы Джона Хопкинса и Арнольдом Левином из Принстонского университета. Гильермина Лозано, работавшая в онкологическом центре MD Anderson, впоследствии идентифицировала p53 как транскрипционный фактор. Уоррен Мальцман из Института Ваксмана Университета Ратгерса впервые показал, что TP53 реагирует на повреждение ДНК, вызванное ультрафиолетовым излучением. В серии публикаций в 1991–1992 годах Майкл Кастан из Университета Джона Хопкинса сообщил, что TP53 является ключевым компонентом сигнального пути, помогающего клеткам реагировать на повреждение ДНК. В 1993 году журнал Science назвал p53 молекулой года.