Реактивные формы кислорода: образование, функции и роль в биологических процессах.

Введение

Высокореактивные молекулы, образованные из двуатомного кислорода (O₂).

В химии и биологии реактивные виды кислорода (ROS) – это высокореактивные химические вещества, образующиеся из двуатомного кислорода (O₂), воды и перекиси водорода. К числу наиболее известных ROS относятся гидропероксид (O₂H), супероксид (O₂⁻), гидроксильный радикал (OH•) и синглетный кислород. ROS широко распространены, поскольку они легко образуются из O₂, который в изобилии присутствует в природе. ROS важны во многих аспектах, как положительных, так и отрицательных. ROS функционируют как сигнальные молекулы, включающие и выключающие биологические функции. Они являются промежуточными продуктами окислительно-восстановительного поведения O₂, которое играет центральную роль в топливных элементах. ROS играют ключевую роль в фоторазложении органических загрязнителей в атмосфере. Однако чаще всего ROS рассматриваются в биологическом контексте, начиная от их влияния на старение и их роли в возникновении опасных генетических мутаций.

Эндогенные источники

РОС образуются в процессах дыхания и фотосинтеза в органеллах, таких как митохондрии, пероксисомы и хлоропласты. В процессе дыхания митохондрии преобразуют энергию для клетки в полезную форму – аденозинтрифосфат (АТФ). Процесс производства АТФ в митохондриях, называемый окислительным фосфорилированием, включает в себя транспорт протонов (ионов водорода) через внутреннюю митохондриальную мембрану посредством цепи транспорта электронов. В цепи транспорта электронов электроны проходят через ряд белков посредством окислительно-восстановительных реакций, при этом каждый акцепторный белок вдоль цепи имеет более высокий потенциал восстановления, чем предыдущий. Конечным пунктом назначения электрона вдоль этой цепи является молекула кислорода. В нормальных условиях кислород восстанавливается до воды; однако, примерно в 0,1–2% электронов, проходящих через цепь (это значение получено из исследований изолированных митохондрий, хотя точная скорость в живых организмах до сих пор остается предметом обсуждения), кислород вместо этого преждевременно и не полностью восстанавливается, образуя супероксидный радикал (•O2−), наиболее хорошо изученный для комплексов I и III. Другим источником образования РОС в животных клетках являются реакции переноса электронов, катализируемые митохондриальными системами P450 в стероидогенных тканях. Эти системы P450 зависят от переноса электронов от NADPH к P450. В ходе этого процесса часть электронов "утекает" и реагирует с O2, образуя супероксид. Для нейтрализации этого естественного источника РОС стероидогенные ткани, яичники и яички содержат высокую концентрацию антиоксидантов, таких как витамин С (аскорбат) и β-каротин, а также антиоксидантных ферментов. Если митохондрии подвергаются слишком сильным повреждениям, клетка запускает апоптоз или запрограммированную клеточную гибель. Кроме того, РОС образуются при передаче сигналов в иммунных клетках посредством NOX-пути. Фагоцитарные клетки, такие как нейтрофилы, эозинофилы и мононуклеарные фагоциты, производят РОС при стимуляции. В хлоропластах реакции карбоксилирования и оксигенации, катализируемые рубиско, обеспечивают функционирование цепи транспорта электронов (ETC) в среде, богатой O2. Утечка электронов в ETC неизбежно приводит к образованию РОС в хлоропластах. В случаях перегрузки ETC часть потока электронов отклоняется от ферредоксина к O2, образуя супероксидный радикал (реакцией Мелера). Кроме того, утечка электронов к O2 может происходить и из 2Fe 2S и 4Fe 4S кластеров в ETC PSI. Однако PSII также предоставляет места утечки электронов (QA, QB) для образования O2. Супероксид (O2•) генерируется из PSII, а не PSI; QB указан как место генерации O2•. Образование 1O2 в хлоропластах может вызвать перепрограммирование экспрессии генов ядра, приводящее к хлорозу и запрограммированной клеточной гибели. Первая фаза накопления РОС связана с инфекцией растений и, вероятно, не зависит от синтеза новых ферментов, генерирующих РОС. Вторая фаза накопления РОС связана только с инфекцией не вирулентными патогенами и является индуцированным ответом, зависящим от увеличения транскрипции мРНК, кодирующей ферменты.

ROS are produced during the processes of respiration and photosynthesis in organelles such as mitochondria, peroxisomes and chloroplasts. During the respiration process the mitochondria convert energy for the cell into a usable form, adenosine triphosphate (ATP). The process of ATP production in the mitochondria, called oxidative phosphorylation, involves the transport of protons (hydrogen ions) across the inner mitochondrial membrane by means of the electron transport chain. In the electron transport chain, electrons are passed through a series of proteins via oxidation reduction reactions, with each acceptor protein along the chain having a greater reduction potential than the previous. The last destination for an electron along this chain is an oxygen molecule. In normal conditions, the oxygen is reduced to produce water; however, in about 0.1–2% of electrons passing through the chain (this number derives from studies in isolated mitochondria, though the exact rate in live organisms is yet to be fully agreed upon), oxygen is instead prematurely and incompletely reduced to give the superoxide radical (•O2−), most well documented for Complex I and Complex III. Another source of ROS production in animal cells is the electron transfer reactions catalyzed by the mitochondrial P450 systems in steroidogenic tissues. These P450 systems are dependent on the transfer of electrons from NADPH to P450. During this process, some electrons "leak" and react with O2 producing superoxide. To cope with this natural source of ROS, the steroidogenic tissues, ovary and testis, have a large concentration of antioxidants such as vitamin C (ascorbate) and β carotene and anti oxidant enzymes. If too much damage is present in mitochondria, a cell undergoes apoptosis or programmed cell death. In addition, ROS are produced in immune cell signaling via the NOX pathway. Phagocytic cells such as neutrophils, eosinophils, and mononuclear phagocytes produce ROS when stimulated. In chloroplasts, the carboxylation and oxygenation reactions catalyzed by rubisco ensure that the functioning of the electron transport chain (ETC) occurs in an environment rich in O2. The leakage of electrons in the ETC will inevitably produce ROS within the chloroplasts. In cases where there is an ETC overload, part of the electron flow is diverted from ferredoxin to O2, forming the superoxide free radical (by the Mehler reaction). In addition, electron leakage to O2 can also occur from the 2Fe 2S and 4Fe 4S clusters in the PSI ETC. However, PSII also provides electron leakage locations (QA, QB) for O2 producing O2 Superoxide (O2 ) is generated from PSII, instead of PSI; QB is shown as the location for the generation of O2• The production of 1O2 in chloroplasts can cause reprogramming of the expression of nucleus genes leading to chlorosis and programmed cell death. The first phase of ROS accumulation is associated with plant infection and is probably independent of the synthesis of new ROS generating enzymes. However, the second phase of ROS accumulation is associated only with infection by non virulent pathogens and is an induced response dependent on increased mRNA transcription encoding enzymes.

Вредные последствия

Влияние реактивных видов кислорода (РОС) на клеточный метаболизм хорошо задокументировано у различных видов. РОС влияют на экспрессию генов и мобилизацию ионных транспортеров, что указывает на их участие в контроле клеточных функций. В частности, тромбоциты, участвующие в восстановлении ран и поддержании гомеостаза крови, высвобождают РОС для привлечения дополнительных тромбоцитов к местам повреждения. Это также обеспечивает связь с адаптивной иммунной системой посредством привлечения лейкоцитов. Реактивные виды кислорода вовлечены в клеточную активность, лежащую в основе различных воспалительных реакций, включая сердечно-сосудистые заболевания. Они также могут быть связаны с нарушением слуха, вызванным повреждением улитки при повышенном уровне звука, ототоксичностью препаратов, таких как цисплатин, и врожденной глухотой у животных и людей. РОС также участвуют в опосредовании апоптоза, или запрограммированной гибели клеток, и ишемической травмы, примерами которой являются инсульт и сердечный приступ. В целом, вредное воздействие реактивных видов кислорода на клетку проявляется в повреждении ДНК или РНК, окислении полиненасыщенных жирных кислот в липидах (липидной пероксидации), окислении аминокислот в белках и окислительной деактивации специфических ферментов посредством окисления кофакторов.

Ответ патогена

Когда растение распознает атакующий патоген, одной из первых индуцированных реакций является быстрое производство супероксида (O2⁻) или перекиси водорода для укрепления клеточной стенки. Это предотвращает распространение патогена на другие части растения, по сути формируя барьер вокруг патогена для ограничения его передвижения и размножения. У млекопитающих ROS индуцируется как противомикробная защита. Урацил, высвобождаемый микроорганизмами, запускает выработку и активность DUOX – фермента, продуцирующего ROS в кишечнике. Активность DUOX индуцируется в соответствии с уровнем урацила в кишечнике; в базовых условиях она подавляется протеинкиназой MkP3. Строгая регуляция DUOX позволяет избежать избыточного производства ROS и облегчает дифференциацию между безвредными и повреждающими микроорганизмами в кишечнике. Механизм, посредством которого ROS защищает организм от вторжения микробов, изучен не полностью. Один из наиболее вероятных способов защиты – повреждение микробной ДНК. Исследования с использованием Salmonella показали, что для устойчивости к гибели, вызванной ROS, необходимы механизмы репарации ДНК. Роль ROS в антивирусных защитных механизмах продемонстрирована посредством Rig-подобной геликазы 1 и митохондриального антивирусного сигнального белка. Повышенные уровни ROS усиливают передачу сигналов через этот митохондриально-ассоциированный антивирусный рецептор для активации интерферон-регуляторного фактора (IRF) 3, IRF 7 и ядерного фактора каппа B (NF κB), что приводит к антивирусному состоянию. Респираторные эпителиальные клетки индуцируют митохондриальный ROS в ответ на инфекцию гриппом. Эта индукция ROS привела к индукции интерферона III типа и индукции антивирусного состояния, ограничивающего репликацию вируса. В защите организма от микобактерий ROS играют роль, хотя прямое уничтожение, вероятно, не является ключевым механизмом; скорее всего, ROS влияет на ROS-зависимые сигнальные пути, такие как продукция цитокинов, аутофагия и формирование гранулем. Реактивные кислородные виды также вовлечены в активацию, анергию и апоптоз Т-клеток.

When a plant recognizes an attacking pathogen, one of the first induced reactions is to rapidly produce superoxide (O2 ) or hydrogen peroxide to strengthen the cell wall. This prevents the spread of the pathogen to other parts of the plant, essentially forming a net around the pathogen to restrict movement and reproduction. In the mammalian host, ROS is induced as an antimicrobial defense. The uracil released by microorganism triggers the production and activity of DUOX, the ROS producing enzyme in the intestine. DUOX activity is induced according to the level of uracil in the gut; under basal conditions, it is down regulated by the protein kinase MkP3. The tight regulation of DUOX avoids excessive production of ROS and facilitates differentiation between benign and damage inducing microorganisms in the gut. The manner in which ROS defends the host from invading microbe is not fully understood. One of the more likely modes of defense is damage to microbial DNA. Studies using Salmonella demonstrated that DNA repair mechanisms were required to resist killing by ROS. A role for ROS in antiviral defense mechanisms has been demonstrated via Rig like helicase 1 and mitochondrial antiviral signaling protein. Increased levels of ROS potentiate signaling through this mitochondria associated antiviral receptor to activate interferon regulatory factor (IRF) 3, IRF 7, and nuclear factor kappa B (NF κB), resulting in an antiviral state. Respiratory epithelial cells induce mitochondrial ROS in response to influenza infection. This induction of ROS led to the induction of type III interferon and the induction of an antiviral state, limiting viral replication. In host defense against mycobacteria, ROS play a role, although direct killing is likely not the key mechanism; rather, ROS likely affect ROS dependent signalling controls, such as cytokine production, autophagy, and granuloma formation. Reactive oxygen species are also implicated in activation, anergy and apoptosis of T cells.

Окислительное повреждение

В аэробных организмах энергия, необходимая для биологических функций, вырабатывается в митохондриях посредством цепи переноса электронов. Реактивные виды кислорода (РОС), потенциально способные вызывать повреждение клеток, образуются одновременно с высвобождением энергии. РОС могут повреждать липиды, ДНК, РНК и белки, что, в теории, вносит вклад в физиологию старения. РОС являются нормальным продуктом клеточного метаболизма. В частности, одним из основных источников окислительного повреждения является перекись водорода (H2O2), которая образуется из супероксида, выходящего из митохондрий. Каталаза и супероксиддисмутаза смягчают повреждающее действие перекиси водорода и супероксида, соответственно, преобразуя эти соединения в кислород и перекись водорода (которая впоследствии превращается в воду), что приводит к образованию безвредных молекул. Однако это преобразование не является на 100% эффективным, и остаточные пероксиды остаются в клетке. Хотя РОС образуются как продукт нормальной клеточной функции, их избыток может вызывать негативные последствия.

Нарушение когнитивных функций

С возрастом снижаются когнитивные способности, что проявляется в дегенеративных заболеваниях человека, таких как болезнь Альцгеймера, сопровождающаяся накоплением окислительного повреждения. Современные исследования демонстрируют, что накопление активных форм кислорода (АФК) может снижать жизнеспособность организма, поскольку окислительное повреждение является фактором, способствующим старению. В частности, накопление окислительного повреждения может приводить к когнитивным нарушениям, что было показано в исследовании, в котором пожилым крысам давали митохондриальные метаболиты, после чего им проводили когнитивные тесты. Результаты показали, что крысы демонстрировали лучшие результаты после получения метаболитов, что позволяет предположить, что метаболиты снизили окислительное повреждение и улучшили функцию митохондрий. Накопление окислительного повреждения может влиять на эффективность работы митохондрий и дополнительно увеличивать скорость образования АФК. Накопление окислительного повреждения и его влияние на процессы старения зависят от конкретного типа ткани, в которой происходит повреждение. Дополнительные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что окислительное повреждение является причиной возрастного снижения функций мозга. У пожилых песчанок было обнаружено более высокое содержание окисленных белков по сравнению с молодыми особями. Лечение старых и молодых мышей спиноловушкой привело к снижению уровня окисленных белков у пожилых песчанок, но не оказало влияния на молодых. Кроме того, пожилые песчанки лучше справлялись с когнитивными задачами во время лечения, но прекращали демонстрировать функциональную активность после его отмены, что приводило к увеличению уровня окисленных белков. Это позволило исследователям сделать вывод, что окисление клеточных белков потенциально играет важную роль в функционировании мозга.

Причина старения

Согласно теории старения, вызванной свободными радикалами, окислительное повреждение, инициированное реактивными формами кислорода, является одним из основных факторов, способствующих функциональному снижению, характерному для старения. Исследования на беспозвоночных моделях показывают, что животные, генетически модифицированные для отсутствия определенных антиоксидантных ферментов (таких как SOD), как правило, демонстрируют сокращенную продолжительность жизни (что соответствует ожиданиям, основанным на теории). Однако обратная манипуляция – повышение уровня антиоксидантных ферментов – дала неоднозначные результаты в отношении продолжительности жизни (хотя некоторые исследования на дрозофилах показали, что продолжительность жизни может быть увеличена за счет сверхэкспрессии MnSOD или ферментов, биосинтезирующих глутатион). Вопреки этой теории, удаление митохондриального SOD2 может продлить продолжительность жизни у Caenorhabditis elegans. У мышей ситуация в целом схожа. Удаление антиоксидантных ферментов обычно приводит к сокращению продолжительности жизни, хотя исследования сверхэкспрессии не привели (за некоторыми исключениями) к последовательному увеличению продолжительности жизни. Исследование модели преждевременного старения на крысах выявило повышенный окислительный стресс, снижение активности антиоксидантных ферментов и значительно большее повреждение ДНК в неокортексе и гиппокампе мозга крыс с преждевременным старением по сравнению с контрольными крысами, стареющими естественным образом. Повреждение ДНК 8-OHdG является продуктом взаимодействия ROS с ДНК. Многочисленные исследования показали, что уровень 8-OHdG увеличивается с возрастом (см. теорию повреждения ДНК при старении).

Рак

РОС постоянно генерируются и утилизируются в биологической системе и необходимы для активации регуляторных путей. В нормальных физиологических условиях клетки контролируют уровень РОС, поддерживая баланс между их образованием и элиминацией с помощью систем антиоксидантной защиты. Однако в условиях окислительного стресса избыток РОС может повреждать клеточные белки, липиды и ДНК, приводя к летальным повреждениям клетки, способствующим канцерогенезу. Раковые клетки демонстрируют более высокий уровень окислительного стресса, чем нормальные, отчасти из-за онкогенной стимуляции, повышенной метаболической активности и дисфункции митохондрий. РОС – это палка о двух концах. С одной стороны, при низких концентрациях РОС способствуют выживанию раковых клеток, поскольку прогрессирование клеточного цикла, индуцированное факторами роста и рецепторными тирозинкиназами (RTK), требует РОС для активации, а хроническое воспаление – ключевой медиатор рака – регулируется РОС. С другой стороны, высокие уровни РОС могут подавлять рост опухоли за счет устойчивой активации ингибиторов клеточного цикла и индукции гибели клеток, а также клеточного старения, посредством повреждения макромолекул. Фактически, большинство химио- и радиотерапевтических агентов уничтожают раковые клетки, усиливая окислительный стресс. Способность раковых клеток различать РОС как сигнал выживания или апоптоза определяется дозой, продолжительностью, типом и местом образования РОС. Для выживания раковым клеткам требуются умеренные уровни РОС, в то время как избыточные – приводят к их гибели. Метаболическая адаптация в опухолях уравновешивает потребность клеток в энергии с не менее важной потребностью в строительных блоках для макромолекул и более строгом контроле окислительно-восстановительного гомеостаза. В результате значительно повышается продукция NADPH, который функционирует как кофактор, обеспечивающий восстановительную силу во многих ферментативных реакциях для биосинтеза макромолекул и одновременно защищая клетки от избыточного количества РОС, образующегося при быстром пролиферации. Клетки компенсируют вредное воздействие РОС, производя антиоксидантные молекулы, такие как восстановленный глутатион (GSH) и тиоредоксин (TRX), которые зависят от восстановительной силы NADPH для поддержания своей активности. Большинство факторов риска, связанных с раком, взаимодействуют с клетками посредством генерации РОС. Затем РОС активируют различные факторы транскрипции, такие как ядерный фактор kappa B (NFκB), активаторный белок 1 (AP-1), индуцируемый гипоксией фактор 1α и сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 3 (STAT3), что приводит к экспрессии белков, контролирующих воспаление, клеточную трансформацию, выживание опухолевых клеток, пролиферацию опухолевых клеток, а также инвазию, ангиогенез и метастазирование. Кроме того, РОС контролируют экспрессию различных генов-супрессоров опухолей, таких как p53, ген ретинобластомы (Rb) и PTEN (фосфатаза и гомолог тензина).

ROS are constantly generated and eliminated in the biological system and are required to drive regulatory pathways. Under normal physiological conditions, cells control ROS levels by balancing the generation of ROS with their elimination by scavenging systems. But under oxidative stress conditions, excessive ROS can damage cellular proteins, lipids and DNA, leading to fatal lesions in the cell that contribute to carcinogenesis. Cancer cells exhibit greater ROS stress than normal cells do, partly due to oncogenic stimulation, increased metabolic activity and mitochondrial malfunction. ROS is a double edged sword. On one hand, at low levels, ROS facilitates cancer cell survival since cell cycle progression driven by growth factors and receptor tyrosine kinases (RTK) require ROS for activation and chronic inflammation, a major mediator of cancer, is regulated by ROS. On the other hand, a high level of ROS can suppress tumor growth through the sustained activation of cell cycle inhibitor and induction of cell death as well as senescence by damaging macromolecules. In fact, most of the chemotherapeutic and radiotherapeutic agents kill cancer cells by augmenting ROS stress. The ability of cancer cells to distinguish between ROS as a survival or apoptotic signal is controlled by the dosage, duration, type, and site of ROS production. Modest levels of ROS are required for cancer cells to survive, whereas excessive levels kill them. Metabolic adaptation in tumours balances the cells' need for energy with equally important need for macromolecular building blocks and tighter control of redox balance. As a result, production of NADPH is greatly enhanced, which functions as a cofactor to provide reducing power in many enzymatic reactions for macromolecular biosynthesis and at the same time rescuing the cells from excessive ROS produced during rapid proliferation. Cells counterbalance the detrimental effects of ROS by producing antioxidant molecules, such as reduced glutathione (GSH) and thioredoxin (TRX), which rely on the reducing power of NADPH to maintain their activities. Most risk factors associated with cancer interact with cells through the generation of ROS. ROS then activate various transcription factors such as nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells (NF κB), activator protein 1 (AP 1), hypoxia inducible factor 1α and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), leading to expression of proteins that control inflammation; cellular transformation; tumor cell survival; tumor cell proliferation; and invasion, angiogenesis as well as metastasis. And ROS also control the expression of various tumor suppressor genes such as p53, retinoblastoma gene (Rb), and phosphatase and tensin homolog (PTEN).

Карциногенез

Окисление ДНК, связанное с активными формами кислорода (АФК), является одной из основных причин мутаций, которые могут вызывать различные типы повреждений ДНК, включая не объемные (8-оксогуанин и формамидопиримидин) и объемные (циклопуриновые и этеновые аддукты) модификации оснований, абазические участки, неклассические одноцепочечные разрывы, белковые аддукты ДНК, а также внутри- и межцепочечные сшивки ДНК. По оценкам, эндогенные АФК, образующиеся в результате нормального клеточного метаболизма, модифицируют около 20 000 оснований ДНК в день в одной клетке. 8-оксогуанин является наиболее распространенным из различных окисленных азотистых оснований. Во время репликации ДНК полимераза ошибочно спаривает 8-оксогуанин с аденином, что приводит к G→T трансверсии. Возникающая геномная нестабильность напрямую способствует канцерогенезу. Клеточная трансформация приводит к развитию рака, а взаимодействие атипичной изоформы PKC ζ с p47phox регулирует продукцию АФК и трансформацию апоптотических раковых стволовых клеток посредством программы экстренной защиты "блеббишилд".

Пролиферация клеток

Неконтролируемая пролиферация является отличительной чертой раковых клеток. Как экзогенные, так и эндогенные активные формы кислорода (АФК) показали способность усиливать пролиферацию раковых клеток. Роль АФК в стимулировании пролиферации опухоли дополнительно подтверждается тем, что вещества, потенциально способные ингибировать образование АФК, также могут ингибировать пролиферацию раковых клеток.

Положительная роль РОС в памяти

Реактивные формы кислорода (РОС) критически важны для формирования памяти. РОС также играют центральную роль в эпигенетическом деметилировании ДНК, что актуально для обучения и памяти. В ядерной ДНК млекопитающих метильная группа может быть присоединена ДНК-метилтрансферазой к 5-му углероду цитозина, образуя 5mC (см. красную метильную группу, добавленную для образования 5mC в верхней части первой фигуры). ДНК-метилтрансферазы чаще всего формируют 5mC в динуклеотидной последовательности "цитозин-фосфат-гуанин", образуя 5mCpG. Это присоединение является основным типом эпигенетических изменений и может подавлять экспрессию генов. Метилированный цитозин также может быть деметилирован, что является эпигенетическим изменением, способным повышать экспрессию гена. Ключевым ферментом, участвующим в деметилировании 5mCpG, является TET1. Однако TET1 способен действовать на 5mCpG только после того, как РОС воздействуют на гуанин, образуя 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG), что приводит к образованию динуклеотида 5mCp 8-OHdG.