Каулобактер кресцентус: Модельный организм для изучения клеточного цикла бактерий.

Введение

Вид бактерии Caulobacter crescentus – это грамотрицательная олиготрофная бактерия, широко распространенная в пресноводных озерах и ручьях. Более корректным названием для этого таксона является Caulobacter vibrioides (Henrici и Johnson, 1935). Использование этого организма в качестве модельного началось с работ биолога развития Люси Шапиро.

Штаммы

В лаборатории исследователи различают штамм C. crescentus CB15 (штамм, первоначально выделенный из пресноводного озера) и NA1000 (основной экспериментальный штамм). В штамме NA1000, полученном из CB15 в 1970-х годах, клетки с ножками и клетки, готовящиеся к делению, можно физически отделить в лаборатории от новых клеток-роя, в то время как типы клеток штамма CB15 физически разделить не удается. Изолированные клетки-рои можно затем выращивать как синхронизированную клеточную культуру. Детальное изучение молекулярного развития этих клеток по мере прохождения клеточного цикла позволило исследователям глубоко понять регуляцию клеточного цикла Caulobacter. Благодаря этой возможности физической синхронизации штамм NA1000 стал преобладающим экспериментальным штаммом Caulobacter во всем мире. Дополнительные фенотипические различия между двумя штаммами впоследствии накапливались из-за селективного давления на штамм NA1000 в лабораторных условиях. Генетическая основа фенотипических различий между двумя штаммами заключается в кодирующих, регуляторных и полиморфизмах вставки/удаления в пяти хромосомных локусах.

Генемика

Геном Caulobacter CB15 содержит 4 016 942 пары оснований в одной кольцевой хромосоме, кодирующей 3 767 генов. Геном включает в себя несколько кластеров генов, кодирующих белки, необходимые для выживания в условиях недостатка питательных веществ. Среди них гены, участвующие в хемотаксисе, функционировании внешних мембранных каналов, деградации ароматических соединений и расщеплении углеродных источников растительного происхождения, а также множество сигма-факторов экстрацитоплазматической функции, обеспечивающих организму способность реагировать на широкий спектр изменений в окружающей среде. В 2010 году был секвенирован штамм Caulobacter NA1000, и все различия между ним и штаммом CB15 "дикого типа" были установлены.

Роль стадии роя клеток

Стадия клеток с ножкой Caulobacter обеспечивает преимущество в выживаемости, прикрепляя клетки к поверхностям для формирования биопленок и/или использования источников питательных веществ. Как правило, бактериальные виды, которые делятся быстрее, наиболее эффективно используют ресурсы и занимают экологические ниши. Однако у Caulobacter есть стадия подвижной клетки, что приводит к более медленному росту популяции. Считается, что подвижная клетка обеспечивает расселение клеток, позволяя организму постоянно искать новые среды обитания. Это может быть особенно полезно в условиях сильного дефицита питательных веществ, когда скудные доступные ресурсы могут быть быстро истощены. Многие, возможно, большинство, дочерних клеток подвижного типа не найдут подходящую среду, но обязательная стадия расселения должна повышать репродуктивную приспособленность вида в целом.

Клеточный цикл

Система регуляции клеточного цикла Caulobacter контролирует множество модульных подсистем, которые организуют последовательность роста и размножения клеток. Система управления, построенная на основе биохимических и генетических логических схем, организует время запуска каждой из этих подсистем. Центральным элементом регуляции клеточного цикла является циклическая генетическая цепь – «двигатель» клеточного цикла, основанный на последовательных взаимодействиях пяти ключевых регуляторных белков: DnaA, GcrA, CtrA, SciP и CcrM, роли которых были установлены в лабораториях Люси Шапиро и Харли МакАдамса. Эти пять белков непосредственно контролируют время экспрессии более 200 генов. Пять ключевых регуляторных белков синтезируются, а затем последовательно удаляются из клетки в течение клеточного цикла. Для нормального функционирования этого «двигателя» клеточного цикла также необходимы несколько дополнительных путей клеточной сигнализации. Основная роль этих путей – обеспечение надежной продукции и удаления белка CtrA из клетки в строго определенные моменты клеточного цикла. Важная особенность клеточного цикла Caulobacter заключается в том, что хромосома реплицируется один раз и только один раз за цикл. Это отличается от клеточного цикла E. coli, где могут одновременно протекать перекрывающиеся раунды репликации хромосом. Противоположные функции белков DnaA и CtrA Caulobacter имеют решающее значение для жесткого контроля репликации хромосом Caulobacter. Белок DnaA действует в начале репликации, инициируя репликацию хромосомы. Белок CtrA, напротив, блокирует начало репликации, поэтому его необходимо удалить из клетки до начала репликации хромосом. Множество дополнительных регуляторных путей, являющихся неотъемлемой частью регуляции клеточного цикла и включающих как фосфосигналинг, так и регулируемый контроль протеолиза, обеспечивают присутствие белков DnaA и CtrA в клетке именно тогда, когда это необходимо. Каждый процесс, активируемый белками «двигателя» клеточного цикла, включает в себя каскад множества реакций. Самым длинным каскадом подсистем является репликация ДНК. В клетках Caulobacter репликация хромосомы включает около 2 миллионов реакций синтеза ДНК на каждую руку хромосомы в течение 40–80 минут, в зависимости от условий. Хотя среднее время для каждой отдельной реакции синтеза можно оценить на основе наблюдаемого среднего общего времени репликации хромосомы, фактическое время реакции для каждой реакции значительно варьируется вокруг среднего значения. Это приводит к существенной и неизбежной вариации времени завершения репликации хромосомы от клетки к клетке. Аналогичная случайная вариация наблюдается и в скорости протекания каскадов реакций всех остальных подсистем. В результате время завершения клеточного цикла значительно варьируется среди клеток в популяции, даже если все они растут в идентичных условиях окружающей среды. Регуляция клеточного цикла включает сигналы обратной связи, которые регулируют скорость прогрессирования «двигателя» клеточного цикла, чтобы она соответствовала прогрессу событий на уровне регуляторных подсистем в каждой конкретной клетке. Такая организация системы управления, с контроллером («двигателем» клеточного цикла), управляющим сложной системой, с модуляцией сигналами обратной связи от контролируемой системы, создает систему управления замкнутым циклом. Скорость прогрессирования клеточного цикла дополнительно регулируется сигналами от клеточных сенсоров, которые контролируют условия окружающей среды (например, уровень питательных веществ и кислорода) или внутреннее состояние клетки (например, наличие повреждений ДНК).

The Caulobacter cell cycle regulatory system controls many modular subsystems that organize the progression of cell growth and reproduction. A control system constructed using biochemical and genetic logic circuitry organizes the timing of initiation of each of these subsystems. The central feature of the cell cycle regulation is a cyclical genetic circuit—a cell cycle engine—that is centered around the successive interactions of five master regulatory proteins: DnaA, GcrA, CtrA, SciP, and CcrM whose roles were worked out by the laboratories of Lucy Shapiro and Harley McAdams. These five proteins directly control the timing of expression of over 200 genes. The five master regulatory proteins are synthesized and then eliminated from the cell one after the other over the course of the cell cycle. Several additional cell signaling pathways are also essential to the proper functioning of this cell cycle engine. The principal role of these signaling pathways is to ensure reliable production and elimination of the CtrA protein from the cell at just the right times in the cell cycle. An essential feature of the Caulobacter cell cycle is that the chromosome is replicated once and only once per cell cycle. This is in contrast to the E. coli cell cycle where there can be overlapping rounds of chromosome replication simultaneously underway. The opposing roles of the Caulobacter DnaA and CtrA proteins are essential to the tight control of Caulobacter chromosome replication. The DnaA protein acts at the origin of replication to initiate the replication of the chromosome. The CtrA protein, in contrast, acts to block initiation of replication, so it must be removed from the cell before chromosome replication can begin. Multiple additional regulatory pathways integral to cell cycle regulation and involving both phospho signaling pathways and regulated control of protein proteolysis act to assure that DnaA and CtrA are present in the cell just exactly when needed. Each process activated by the proteins of the cell cycle engine involve a cascade of many reactions. The longest subsystem cascade is DNA replication. In Caulobacter cells, replication of the chromosome involves about 2 million DNA synthesis reactions for each arm of the chromosome over 40 to 80 min depending on conditions. While the average time for each individual synthesis reaction can be estimated from the observed average total time to replicate the chromosome, the actual reaction time for each reaction varies widely around the average rate. This leads to a significant and inevitable cell to cell variation time to complete replication of the chromosome. There is similar random variation in the rates of progression of all the other subsystem reaction cascades. The net effect is that the time to complete the cell cycle varies widely over the cells in a population even when they all are growing in identical environmental conditions. Cell cycle regulation includes feedback signals that pace progression of the cell cycle engine to match progress of events at the regulatory subsystem level in each particular cell. This control system organization, with a controller (the cell cycle engine) driving a complex system, with modulation by feedback signals from the controlled system creates a closed loop control system. The rate of progression of the cell cycle is further adjusted by additional signals arising from cellular sensors that monitor environmental conditions (for example, nutrient levels and the oxygen level) or the internal cell status (for example, presence of DNA damage).

Эволюционная консервация системы контроля клеточного цикла

Контрольная схема, направляющая и регулирующая ход клеточного цикла Caulobacter, включает в себя всю клетку, функционирующую как единая интегрированная система. Эта схема отслеживает состояние окружающей среды и внутреннее состояние клетки, включая её топологию, координируя активацию подсистем клеточного цикла и асимметричное деление клеток Caulobacter crescentus. Белки системы контроля клеточного цикла Caulobacter и её внутренней организации широко консервативны у многих видов альфапротеобактерий, однако функциональность регуляторного аппарата и его периферические связи с другими клеточными подсистемами значительно различаются от вида к виду. Система управления клеточным циклом Caulobacter была тонко оптимизирована эволюционным отбором как целостная система для устойчивой работы в условиях внутреннего стохастического шума и неопределенности окружающей среды. Система управления бактериальной клеткой имеет иерархическую организацию. Подсистема сигнализации и управления взаимодействует с окружающей средой посредством сенсорных модулей, преимущественно расположенных на поверхности клетки. Логика генетической сети реагирует на сигналы, поступающие из окружающей среды и от внутренних датчиков состояния клетки, адаптируя клетку к текущим условиям. Основная функция верхнего уровня управления – обеспечение последовательного выполнения операций, связанных с клеточным циклом. У Caulobacter это достигается за счет генетической регуляторной цепи, состоящей из пяти главных регуляторов и ассоциированной с ними сети фосфорилирования. Сеть фосфосигнализации отслеживает стадию клеточного цикла и играет ключевую роль в осуществлении асимметричного деления клеток. Система контроля клеточного цикла управляет временем и местом инициации репликации хромосом и цитокинеза, а также развитием полярных органелл. В основе всех этих процессов лежат механизмы производства белков и структурных компонентов, а также выработки энергии. Метаболические и катаболические подсистемы, обеспечивающие жизнедеятельность клетки, поставляют энергию и молекулярное сырье для синтеза белков, построения клеточной стенки и других клеточных процессов. Функции поддержания жизнедеятельности двунаправленно связаны с системой контроля клеточного цикла. Однако они могут адаптироваться, в определенной степени независимо от логики управления клеточным циклом, к изменениям состава и концентрации доступных источников питательных веществ. Белки системы контроля клеточного цикла Caulobacter широко консервативны у альфапротеобактерий, но конечная функция этой регуляторной системы значительно варьируется у разных видов. Эти эволюционные изменения отражают огромные различия между отдельными видами в стратегиях выживания и экологических нишах. Например, Agrobacterium tumefaciens является патогеном растений, Brucella abortus – патогеном животных, а Sinorhizobium meliloti – почвенной бактерией, проникающей в корневые клубеньки растений и становящейся симбионтом, фиксирующим азот, однако большинство белков системы контроля клеточного цикла Caulobacter также обнаруживаются у этих видов. Специфическое взаимодействие между белковыми компонентами сети управления клеточным циклом и нисходящими звеньями цепи различается от вида к виду. Характерно, что внутренняя функциональность сетевых схем сохраняется, но связь на "периферии" регуляторного аппарата с белками, контролирующими специфические клеточные функции, значительно различается у разных видов.

The control circuitry that directs and paces Caulobacter cell cycle progression involves the entire cell operating as an integrated system. The control circuitry monitors the environment and the internal state of the cell, including the cell topology, as it orchestrates activation of cell cycle subsystems and Caulobacter crescentus asymmetric cell division. The proteins of the Caulobacter cell cycle control system and its internal organization are co conserved across many alphaproteobacteria species, but there are great differences in the regulatory apparatus' functionality and peripheral connectivity to other cellular subsystems from species to species. The Caulobacter cell cycle control system has been exquisitely optimized by evolutionary selection as a total system for robust operation in the face of internal stochastic noise and environmental uncertainty. The bacterial cell's control system has a hierarchical organization. The signaling and the control subsystem interfaces with the environment by means of sensory modules largely located on the cell surface. The genetic network logic responds to signals received from the environment and from internal cell status sensors to adapt the cell to current conditions. A major function of the top level control is to ensure that the operations involved in the cell cycle occur in the proper temporal order. In Caulobacter, this is accomplished by the genetic regulatory circuit composed of five master regulators and an associated phospho signaling network. The phosphosignaling network monitors the state of progression of the cell cycle and plays an essential role in accomplishing asymmetric cell division. The cell cycle control system manages the time and place of the initiation of chromosome replication and cytokinesis as well as the development of polar organelles. Underlying all these operations are the mechanisms for production of protein and structural components and energy production. The “housekeeping” metabolic and catabolic subsystems provide the energy and the molecular raw materials for protein synthesis, cell wall construction and other operations of the cell. The housekeeping functions are coupled bidirectionally to the cell cycle control system. However, they can adapt, somewhat independently of the cell cycle control logic, to changing composition and levels of the available nutrient sources. The proteins of the Caulobacter cell cycle control system are widely co conserved across the alphaproteobacteria, but the ultimate function of this regulatory system varies widely in different species. These evolutionary changes reflect enormous differences between the individual species in fitness strategies and ecological niches. For example, Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen, Brucella abortus is an animal pathogen, and Sinorhizobium meliloti is a soil bacterium that invades, and becomes a symbiont in, plant root nodules that fix nitrogen yet most of the proteins of the Caulobacter cell cycle control are also found in these species. The specific coupling between the protein components of the cell cycle control network and the downstream readout of the circuit differ from species to species. The pattern is that the internal functionality of the network circuitry is conserved, but the coupling at the “edges” of the regulatory apparatus to the proteins controlling specific cellular functions differs widely among the different species.

Эволюция позиционирования стеблей в кладе Caulobacter

Caulobacter crescentus относится к группе бактерий, обладающих стеблевидной структурой – трубчатым выростом от тела клетки. Однако положение стебля не всегда сохраняется на полюсе тела клетки у различных близкородственных видов. В частности, исследования показали, что в близкородственном роде Asticcacaulis может меняться не только положение, но и количество стеблей. SpmX, полярно локализованный белок в Caulobacter crescentus, способен изменять позиционирование стеблей у этих видов Asticcacaulis. На основании исследований экспериментальной эволюции у C. crescentus, Ackermann et al.

Регулирование полярности ячейки

В C. crescentus клеточная полярность отчетливо видна в сборке полярных органелл и поляризации плоскости деления, что приводит к образованию дочерних клеток со стебельками, которые длиннее дочерних клеток с жгутиками. Формирование новых полюсов клеток при делении подразумевает, что клеточная полярность должна быть восстановлена в дочерних клетках со стебельками и изменена на противоположную в дочерних клетках с жгутиками. Жизненный цикл C. crescentus регулируется регуляторами, такими как TipN – белок клеточного цикла. Данные Йельского университета убедительно подтверждают модель, в которой TipN регулирует ориентацию оси полярности, предоставляя позиционный сигнал из предыдущего клеточного цикла. В этой модели TipN определяет место последнего деления, идентифицируя новый полюс. Клетка использует эту позиционную информацию как источник внутриклеточной асимметрии для установления и поддержания ориентации оси полярности, что критически важно для полярного морфогенеза и деления. Набор TipN к формирующимся полюсам в конце цикла деления переопределяет идентичность полюсов и восстанавливает правильную полярность в обеих будущих дочерних клетках (с инверсией полярности в клетке с жгутиками). TipN содержит два трансмембранных домена в N-концевом регионе и большой C-концевой домен, образующий спираль. Гомологи TipN обнаружены и у других альфа-протеобактерий. После деления TipN локализуется к новому полюсу в обеих дочерних клетках и затем перемещается к месту деления клетки в поздней предделительной клетке. Таким образом, обе дочерние клетки имеют TipN на новом полюсе после деления. Мутанты, лишенные TipN, допускают серьезные ошибки в развитии. Вместо образования единственного жгутика на правильном полюсе клетки, клетка формирует множественные жгутики в различных местах, в том числе и на стебельке.