Антисыворотка: история, применение и производство

Введение

В иммунологии антисыворотка – это кровяная сыворотка, содержащая антитела (моноклональные или поликлональные), используемая для создания пассивного иммунитета ко многим заболеваниям посредством донорства крови (плазмафереза). Например, реконвалесцентная сыворотка, пассивная трансфузия антител от переболевшего человека, ранее была единственным известным эффективным методом лечения инфекции Эбола с высокой выживаемостью – 7 из 8 пациентов. Антисыворотки широко используются в диагностических вирусологических лабораториях. Наиболее распространенное применение антисывороток у людей – это антитоксины или противоядия для лечения отравлений. Серотерапия, также известная как сывороточная терапия, подразумевает лечение инфекционных заболеваний сывороткой животных, иммунизированных против конкретных микроорганизмов или их продуктов, вызывающих данное заболевание.

История

В 1890 году Эмиль Беринг и Китасато Шибасабуро опубликовали свою первую работу о сывороточной терапии. Беринг был пионером в этой области, используя морских свиней для производства сыворотки. Основываясь на наблюдении, что люди, перенесшие инфекцию дифтерийной палочкой, больше не заражались ею, он обнаружил, что организм постоянно вырабатывает антитоксин, предотвращающий повторное заражение тем же возбудителем у выздоровевших. Берингу требовалось иммунизировать крупных животных, чтобы получить достаточно сыворотки для защиты людей, поскольку количество антисыворотки, производимой морскими свинками, было слишком малым для практического применения. Лошади оказались лучшими производителями сыворотки, так как сыворотка других крупных животных недостаточно концентрирована, а лошади, как считалось, не переносили заболеваний, которые могли бы передаться человеку. В связи с Первой мировой войной возникла большая потребность в лошадях для военных нужд. Берингу было трудно найти достаточно немецких лошадей для своей сывороточной станции. Он решил закупать лошадей в странах Восточной Европы, в основном в Венгрии и Польше. Из-за ограниченных финансовых ресурсов Беринга большинство выбранных им лошадей предназначались для убоя; однако их полезность для других не влияла на производство сыворотки. Сывороточные лошади были спокойными, хорошо воспитанными и здоровыми. Возраст, порода, рост и масть были несущественны. Лошадей перевозили из Польши или Венгрии на сывороточную станцию Беринга в Марбурге, расположенную в центрально-западной части Германии. Большинство лошадей перевозились по железной дороге и обращались с ними как с обычным грузом. Во время бесконечных пограничных проверок лошади оставались на волю стихии. По прибытии в Марбург лошадям требовалось три-четыре недели для восстановления в карантинном корпусе, где фиксировались данные о них. Они должны были быть в идеальном состоянии здоровья для иммунизации, и карантинный корпус обеспечивал отсутствие микробов, которые могли бы заразить других лошадей. На сывороточных станциях Беринга лошадей считали спасителями жизней, поэтому к ним относились хорошо. Некоторые из лошадей, используемых для производства сыворотки, получали имена и были отмечены за свой вклад в медицину, как человеческую, так и ветеринарную. В конце XIX века каждый второй ребенок в Германии заражался дифтерией, наиболее частой причиной смерти детей до 15 лет. В 1891 году Эмиль Беринг спас жизнь юной девушки, больной дифтерией, впервые в истории применив антисыворотку. Сывороточные лошади оказались спасителями людей, зараженных дифтерией. Впоследствии были разработаны методы лечения столбняка, бешенства и змеиного яда, а также началась активная профилактическая вакцинация против дифтерии и других микробных заболеваний. В 1901 году Беринг получил первую Нобелевскую премию по физиологии и медицине за свои работы по изучению дифтерии. Сывороточная терапия становилась все более распространенной при инфекционных заболеваниях и даже использовалась для лечения пациентов во время пандемии гриппа 1918 года. Ее применение быстро расширилось и охватило такие заболевания, как полиомиелит, корь, пневмококковая инфекция, гемофильная инфекция типа b и менингококковая инфекция. В 1920-х годах Майкл Хайдельбергер и Освальд Эйвери доказали, что антитела – это белки, нацеленные на капсулу вируса или бактерии. Открытие антибиотиков в 1940-х годах снизило интерес к лечению бактериальных инфекций антисывороткой, но ее применение при вирусных инфекциях сохранилось благодаря разработке фракционирования этанолом плазмы крови (позволяющего получать очищенные антитела), открытой Эдвином Коном. Антисыворотки были разработаны для профилактики и/или лечения дифтерии, столбняка, гепатита B, бешенства, вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, цитомегаловируса и ботулизма. Однако они не получили широкого распространения. В 1984 году Милштейн и Кёлер получили Нобелевскую премию за работу, в которой описали свой метод получения мышиных моноклональных антител путем увековечивания B-клеток в виде гибридом. Еще один прорыв произошел в 2003 году. Новая технология позволила амплифицировать гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина из человеческих B-клеток и клонировать их в экспрессионные векторы. В 2008 году этот метод был усовершенствован за счет повышения способности сортировать клетки и клонировать, что привело к открытию большего количества человеческих моноклональных антител. В 1996 году FDA одобрило применение RSV IGIV (Respigam), поликлонального антитела для ингибирования респираторно-синцитиального вируса (РСВ) у новорожденных из группы риска. Это было признано прорывом, поскольку клинические испытания показали снижение числа госпитализаций младенцев на 41% и продолжительности пребывания в больнице на 53%. Через два года спрос на продукт превысил предложение плазмы, и на смену ему был одобрен Synagis, первое гуманизированное моноклональное антитело. Моноклональные антитела стали более выгодными благодаря снижению вариабельности качества, снижению риска передачи заболеваний через кровь и повышению эффективности. Это позволило значительно расширить область применения антисыворотки и открыть двери для лечения аутоиммунных заболеваний. За последние 30 лет произошла трансформация методов лечения хронических и аутоиммунных заболеваний (например, рака, язвенного колита), было одобрено 30 препаратов – 28 из которых для хронических состояний – на основе моноклональных антител. В настоящее время моноклональные антитела исследуются для лечения вирусных заболеваний без вакцин, таких как ВИЧ, SARS и MERS.

In 1890, Emil Behring and Kitasato Shibasaburō published their first paper on serum therapy. Behring had pioneered the technique, using guinea pigs to produce serum. Based on his observation that people who survived infection with the diphtheria bacterium never became infected again, he discovered that the body continually produces an antitoxin, which prevents survivors of infections from being infected again with the same agent. It was necessary for Behring to immunize larger animals in order to produce enough serum to protect humans, because the amount of antiserum produced by guinea pigs was too little to be practical. Horses proved to be the best serum producer, as the serum of other large animals is not concentrated enough, and horses were not believed to carry any diseases that could be transferred to humans. Due to the First World War, a large number of horses were needed for military purposes. It was difficult for Behring to find enough German horses for his serum facility. He chose to obtain horses from Eastern European countries, mostly Hungary and Poland. Because of Behring's limited financial resources, most horses he selected had been intended for slaughter; however, the usefulness of the animal to others had no influence on the production of serum. Serum horses were calm, well mannered, and in good health. Age, breed, height, and color were irrelevant. Horses were transported from Poland or Hungary to the Behring facilities in Marburg, in the west central part of Germany. Most of the horses were transported by rail and treated like any other freight load. During the interminable border crossing, horses were left at the mercy of the weather. Once the horses arrived in Marburg, they had three to four weeks to recover in a quarantine facility, where data on them was recorded. They had to be in perfect medical condition for the immunization, and the quarantine facility ensured that they were free of microbes which could infect the other horses. In the Behring facilities, the horses were viewed as life savers; therefore, they were well treated. A few of the individual horses used for serum production were named, and celebrated for their service to medicine, both human and non human. At the end of the 19th century, every second child in Germany was infected with diphtheria, the most frequent cause of death in children up to 15 years. In 1891 Emil Behring saved the life of a young girl with diphtheria by injecting antiserum for the first time in history. Serum horses proved to be saviors of diphtheria infected people. Subsequently, treatment of tetanus, rabies, and snake venom developed, and proactive protective vaccination against diphtheria and other microbial diseases began. In 1901, Behring won the first Nobel Prize in Medicine for his work in the study of diphtheria. Serum therapy became increasingly prevalent for infectious diseases, and was even used to treat patients during the influenza pandemic in 1918. Its uses were then quickly expanded to also treat diseases such as polio, measles, pneumococcus, Haemophilus influenza B, and meningococcus. In the 1920s, Michael Heidelberger and Oswald Avery proved that antibodies were proteins that targeted the capsule of the virus or bacteria. The discovery of antibiotics in the 1940s diminished interest in treating bacterial infections with antiserum, but its use for viral infections continued with the development of ethanol fractionation of blood plasma (which allowed for purified antibodies), discovered by Edwin Cohn. Antisera were developed to prevent and/or treat diphtheria, tetanus, Hepatitis B, rabies, varicella zoster virus, cytomegalovirus, and botulinum. However, these were not widely used. In 1984, Milstein and Köhler won a Nobel Prize for their paper that described their method for making murine monoclonal antibodies by immortalizing B cells as hybridomas. Another breakthrough occurred in 2003. A new technology allowed for heavy and light chain immunoglobulin genes to be amplified from human B cells and cloned into expression vectors. In 2008, this method was refined with a greater ability to sort cells and clone, which led to the discovery of more human monoclonal antibodies. In 1996, the FDA approved the use of RSV IGIV (Respigam), a polyclonal antibody drug to inhibit respiratory syncytial virus (RSV) for high risk newborns. This was considered a breakthrough, as the clinical trial was proven to reduce infant hospitalizations by 41% and length of hospital stays by 53%. After two years the product demand began to exceed the supply of plasma and Synagis, the first humanized monoclonal antibody was approved in its place. Monoclonal antibodies became advantageous due to their decreased variability in quality, a decreased risk of bloodborne diseases, and increased potency. This enabled a large expansion of the usages of antiserum and opened the door for the treatment of autoimmune diseases. The past 30 years have seen the transformation of how chronic and autoimmune diseases (e. g. cancer, ulcerative colitis) are treated, with 30 drugs—28 of which for chronic conditions—with monoclonal antibodies being approved. Monoclonal antibodies are currently being researched to treat viral diseases without vaccines, such as HIV, SARS, and MERS.

Как это работает

Антитела в антисыворотке связывают инфекционный агент или антиген. Иммунная система затем распознает чужеродные агенты, связанные с антителами, и запускает более мощный иммунный ответ. Использование антисыворотки особенно эффективно против патогенов, способных уклоняться от иммунной системы в нестимулированном состоянии, но недостаточно устойчивых, чтобы уклоняться от стимулированной иммунной системы. Существование антител к агенту зависит от первоначального выжившего, чья иммунная система случайно обнаружила противоядие к патогену, или от вида хозяина, который переносит патоген, но не испытывает его воздействия. Дальнейшие запасы антисыворотки могут быть получены от первоначального донора или от донора, которому ввели патоген и вылечили с помощью имеющейся антисыворотки. Разбавленный змеиный яд часто используется в качестве антисыворотки для обеспечения пассивного иммунитета к самому змеиному яду. Лошадей, инфицированных патогеном, вакцинировали трижды с последовательным увеличением дозы. Интервал между вакцинациями варьировался у каждой лошади в зависимости от ее состояния здоровья. Обычно лошадям требовалось несколько недель для выработки сыворотки в крови после последней вакцинации. Несмотря на все усилия по усилению иммунной системы лошадей во время этой иммунизации, большинство из них страдали от потери аппетита, лихорадки, а в тяжелых случаях – от шока и затрудненного дыхания. Наибольший риск иммунизации для лошадей был связан с производством антисыворотки против змеиного яда. Лошадь иммунизировали одновременно всеми видами змеиного яда, поскольку не всегда удавалось определить, какой вид змеи совершил укус. Следовательно, сыворотка должна была обеспечить иммунитет субъекта против яда всех видов змей. Для определения момента, когда в крови лошадей вырабатывается максимальное количество антитоксинов, у них регулярно брали образцы крови. Когда было произведено наибольшее количество антител, через канюлю было взято пять литров крови – десятая часть объема крови лошади. Кровь собирали в стеклянный цилиндр и доставляли в лабораторию в учреждение Беринга. Над рулеобразным образованием, содержащим эритроциты, была видна сыворотка. Цвет сыворотки варьировался от молочно-белого до коричневого. Концентрация и стерильность сыворотки тщательно проверялись, и сыворотка многократно фильтровалась. Содержание белка снижали для использования сыворотки у людей. После взятия крови лошадям давали отдохнуть три-четыре недели и обеспечивали дополнительным питанием для восстановления потерянного объема крови. В этот период лошади были особенно ослаблены и подвержены болезням и инфекциям. Спустя несколько лет, благодаря опыту и наблюдениям за лошадьми, рулеобразное образование из образца крови возвращали в организм животного. Эта процедура называется плазмаферезом.

Antibodies in the antiserum bind the infectious agent or antigen. The immune system then recognizes foreign agents bound to antibodies and triggers a more robust immune response. The use of antiserum is particularly effective against pathogens which are capable of evading the immune system in their unstimulated state but are not robust enough to evade the stimulated immune system. The existence of antibodies to the agent depends on an initial survivor whose immune system, by chance, discovered a counteragent to the pathogen or a host species which carries the pathogen but does not experience its effects. Further stocks of antiserum can then be produced from the initial donor or from a donor organism that is inoculated with the pathogen and cured by some stock of pre existing antiserum. Diluted snake venom is often used as an antiserum to give passive immunity to snake venom itself. Horses that were infected by a pathogen were vaccinated thrice in increasing sizes of the dose. The time between each vaccination varied from each horse and its health condition. Normally the horses needed a few weeks to produce the serum in the blood after the last vaccination. Even though they tried to empower the immune system of the horses during this immunization with painstaking care, most of the horses experienced appetite loss, fever, and in worse cases shock and dyspnea. The highest immunization risk for horses was the production of antiserum for snake venom. The horse was immunized with all types of snake poison at the same time because it was not always possible to know by which snake species a person had been bitten. Therefore, the serum had to immunize the subject against the venom of every snake species. In order to find the moment when most antitoxins in the blood cells of the horses is produced, frequent blood samples were taken from the horses. At the point when the highest amount of antibodies were produced, five liters of blood, a tenth of the blood volume of a horse, were taken through a cannula. The blood was collected in a glass cylinder and brought to the laboratory in the Behring facilities. Above the rouleaux formation which contained the red blood cells, the serum was visible. The color of the serum varied from milky to brown. Concentration and sterility of the serum were checked carefully, and the serum was filtered many times. Protein content was decreased in order to use the serum for humans. After the blood sampling, the horses could rest for three to four weeks and received extra food to recover the blood loss. In this period the horses were especially weak and prone to disease and infection. Within a few years, with experience and observation of the horses, a rouleaux formation of the blood sample was placed back into the animal's body. This procedure is called plasmapheresis.