Малоугловое рассеяние в исследовании биологических макромолекул

Введение

Биологическое малоугольное рассеяние – это метод малоугольного рассеяния, используемый для анализа структуры биологических материалов. Малоугольное рассеяние применяется для изучения структуры различных объектов, таких как растворы биологических макромолекул, нанокомпозиты, сплавы и синтетические полимеры. Рассеяние рентгеновских лучей с малым углом (SAXS) и рассеяние нейтронов с малым углом (SANS) – это две взаимодополняющие методики, известные совместно как малоугольное рассеяние (SAS). SAS является аналогичным методом рентгеновской и нейтронной дифракции, широкоугольному рассеянию рентгеновских лучей, а также статическому рассеянию света. В отличие от других методов рентгеновского и нейтронного рассеяния, SAS предоставляет информацию о размерах и формах как кристаллических, так и некристаллических частиц. При изучении биологических материалов, которые часто находятся в водном растворе, картина рассеяния усредняется по ориентации. SAS-диаграммы собираются при малых углах, в несколько градусов. SAS способен предоставлять структурную информацию в диапазоне разрешения от 1 до 25 нм, а также информацию о периодах повторения в частично упорядоченных системах размером до 150 нм. Ультрамалоугольное рассеяние (USAS) позволяет определять еще более крупные размеры. Рассеяние с малым углом при скользящем угле падения (GISAS) – мощная методика для изучения слоев биологических молекул на поверхностях. В биологических приложениях SAS используется для определения структуры частицы по среднему размеру и форме. Также можно получить информацию об отношении площади поверхности к объему. Обычно биологические макромолекулы диспергированы в жидкости. Метод точен, в основном неразрушающ и обычно требует минимальной подготовки образца. Однако биологические молекулы всегда подвержены радиационному повреждению. По сравнению с другими методами определения структуры, такими как ЯМР в растворе или рентгеновская кристаллография, SAS позволяет преодолеть некоторые ограничения. Например, ЯМР в растворе ограничен размером белка, в то время как SAS может использоваться как для малых молекул, так и для крупных мультимолекулярных комплексов. ЯМР в твердом состоянии остается незаменимым инструментом для определения информации об атомном уровне макромолекул с молекулярной массой более 40 кДа или некристаллических образцов, таких как амилоидные фибриллы. Определение структуры с помощью рентгеновской кристаллографии может занять несколько недель или даже лет, в то время как измерения SAS занимают дни. SAS также можно комбинировать с другими аналитическими методами, такими как гель-проникающая хроматография, для изучения гетерогенных образцов. Однако при использовании SAS невозможно измерить положение атомов внутри молекулы.

Biological small angle scattering is a small angle scattering method for structure analysis of biological materials. Small angle scattering is used to study the structure of a variety of objects such as solutions of biological macromolecules, nanocomposites, alloys, and synthetic polymers. Small angle X ray scattering (SAXS) and small angle neutron scattering (SANS) are the two complementary techniques known jointly as small angle scattering (SAS). SAS is an analogous method to X ray and neutron diffraction, wide angle X ray scattering, as well as to static light scattering. In contrast to other X ray and neutron scattering methods, SAS yields information on the sizes and shapes of both crystalline and non crystalline particles. When used to study biological materials, which are very often in aqueous solution, the scattering pattern is orientation averaged. SAS patterns are collected at small angles of a few degrees. SAS is capable of delivering structural information in the resolution range between 1 and 25 nm, and of repeat distances in partially ordered systems of up to 150 nm in size. Ultra small angle scattering (USAS) can resolve even larger dimensions. The grazing incidence small angle scattering (GISAS) is a powerful technique for studying of biological molecule layers on surfaces. In biological applications SAS is used to determine the structure of a particle in terms of average particle size and shape. One can also get information on the surface to volume ratio. Typically, the biological macromolecules are dispersed in a liquid. The method is accurate, mostly non destructive and usually requires only a minimum of sample preparation. However, biological molecules are always susceptible to radiation damage. In comparison to other structure determination methods, such as solution NMR or X ray crystallography, SAS allows one to overcome some restraints. For example, solution NMR is limited to protein size, whereas SAS can be used for small molecules as well as for large multi molecular assemblies. Solid State NMR is still an indispensable tool for determining atomic level information of macromolecules greater than 40 kDa or non crystalline samples such as amyloid fibrils. Structure determination by X ray crystallography may take several weeks or even years, whereas SAS measurements take days. SAS can also be coupled to other analytical techniques like size exclusion chromatography to study heterogeneous samples. However, with SAS it is not possible to measure the positions of the atoms within the molecule.

Метод

Концептуально эксперименты по рассеянию под малым углом просты: образец облучается рентгеновскими лучами или нейтронами, а рассеянное излучение регистрируется детектором. Поскольку измерения SAS проводятся очень близко к первичному лучу («малые углы»), для этой методики требуется высококоллимированный или сфокусированный рентгеновский или нейтронный луч. Биологическое рассеяние рентгеновских лучей под малым углом часто выполняется на источниках синхротронного излучения, поскольку биологические молекулы обычно рассеивают слабо, а исследуемые растворы разбавлены. Биологический метод SAXS использует высокую интенсивность фотонов рентгеновского излучения, обеспечиваемую синхротронными накопителями. Кривая рассеяния рентгеновских лучей или нейтронов (интенсивность в зависимости от угла рассеяния), показанная на рисунке справа, используется для создания модели белка с низким разрешением. Далее можно использовать данные о рассеянии рентгеновских лучей или нейтронов и встроить отдельные домены (структуры, полученные с помощью рентгеновской дифракции или ЯМР) в «конверт SAXS». В эксперименте по рассеянию раствор макромолекул облучается рентгеновскими лучами (с длиной волны λ, обычно около 0,15 нм) или тепловыми нейтронами (λ≈0,5 нм). Рассеянная интенсивность I(s) регистрируется как функция переданного импульса s (s=4πsinθ/λ, где 2θ – угол между падающим и рассеянным излучением). Из интенсивности раствора вычитается рассеяние, обусловленное только растворителем. Случайные положения и ориентации частиц приводят к изотропному распределению интенсивности, которое для монодисперсных невзаимодействующих частиц пропорционально рассеянию от одной частицы, усредненному по всем ориентациям. Результирующее рассеяние частиц пропорционально квадрату разности плотности длины рассеяния (плотности электронов для рентгеновских лучей и ядерной/спиновой плотности для нейтронов) между частицей и растворителем – так называемый контраст. Контраст можно изменять в нейтронном рассеянии, используя смеси H2O/D2O или селективную дейтерацию для получения дополнительной информации. Таким образом, SAS содержит информацию о грубых структурных особенностях – форме, четвертичной и третичной структуре – но не подходит для анализа атомной структуры.

Conceptually, small angle scattering experiments are simple: the sample is exposed to X rays or neutrons and the scattered radiation is registered by a detector. As the SAS measurements are performed very close to the primary beam ("small angles"), the technique needs a highly collimated or focused X ray or neutron beam. The biological small angle X ray scattering is often performed at synchrotron radiation sources, because biological molecules normally scatter weakly and the measured solutions are dilute. The biological SAXS method profits from the high intensity of X ray photon beams provided by the synchrotron storage rings. The X ray or neutron scattering curve (intensity versus scattering angle) is used to create a low resolution model of a protein, shown here on the right picture. One can further use the X ray or neutron scattering data and fit separate domains (X ray or NMR structures) into the "SAXS envelope". In a scattering experiment, a solution of macromolecules is exposed to X rays (with wavelength λ typically around 0.15 nm) or thermal neutrons (λ≈0.5 nm). The scattered intensity I(s) is recorded as a function of momentum transfer s (s=4πsinθ/λ, where 2θ is the angle between the incident and scattered radiation). From the intensity of the solution the scattering from only the solvent is subtracted. The random positions and orientations of particles result in an isotropic intensity distribution which, for monodisperse non interacting particles, is proportional to the scattering from a single particle averaged over all orientations. The net particle scattering is proportional to the squared difference in scattering length density (electron density for X rays and nuclear/spin density for neutrons) between particle and solvent – the so called contrast. The contrast can be varied in neutron scattering using H2O/D2O mixtures or selective deuteration to yield additional information. SAS thus contains information about the gross structural features – shape, quaternary and tertiary structure – but is not suitable for the analysis of the atomic structure.

История

Первые применения относятся к концу 1930-х годов, когда основные принципы SAXS были разработаны в фундаментальной работе Гинье, последовавшей за его исследованиями металлических сплавов. В первой монографии Гвинье и Фурне о SAXS уже было продемонстрировано, что метод предоставляет информацию не только о размерах и форме частиц, но и о внутренней структуре неупорядоченных и частично упорядоченных систем. В 1960-х годах метод стал все более важным в изучении биологических макромолекул в растворе, поскольку позволял получать структурную информацию с низким разрешением об общей форме и внутренней структуре в отсутствие кристаллов. Прорыв в экспериментах SAXS и SANS произошел в 1970-х годах благодаря появлению синхротронного излучения и нейтронных источников, причем последние открыли путь к варьированию контрастности путем обмена растворителя H2O на D2O и применению специфических методов дейтерирования. Было установлено, что исследования рассеяния в растворе предоставляют, при минимальных затратах времени и усилий, ценные сведения о структуре некристаллических биохимических систем. Более того, SAXS/SANS также позволили проводить исследования в реальном времени межмолекулярных взаимодействий, включая сборку и масштабные конформационные изменения в макромолекулярных комплексах. Основная сложность SAS как структурного метода заключается в извлечении трехмерной структурной информации об объекте из одномерных экспериментальных данных. Ранее из экспериментальных данных непосредственно определялись только общие параметры частиц (например, объем, радиус вращения) макромолекул, в то время как анализ с точки зрения трехмерных моделей ограничивался простыми геометрическими телами (например, эллипсоидами, цилиндрами и т.д.) или выполнялся эмпирическим методом проб и ошибок. Электронная микроскопия часто использовалась как ограничение при построении моделей-консенсусов. В 1980-х годах прогресс в других структурных методах привел к снижению интереса биохимиков к исследованиям SAS, которые делали структурные выводы, основываясь лишь на нескольких общих параметрах или на моделях проб и ошибок. 1990-е годы ознаменовались прорывом в методах анализа данных SAXS/SANS, что открыло путь к надежному ab initio моделированию макромолекулярных комплексов, включая детальное определение формы и структуры доменов и применение методов уточнения с жестким телом. Этот прогресс сопровождался дальнейшим совершенствованием приборного оснащения, позволяющим достигать субмиллисекундного временного разрешения на источниках синхротронного излучения третьего поколения при изучении фолдинга белков и нуклеиновых кислот.

First applications date back to the late 1930s when the main principles of SAXS were developed in the fundamental work of Guinier following his studies of metallic alloys. In the first monograph on SAXS by Guinier and Fournet it was already demonstrated that the method yields not only information on the sizes and shapes of particles but also on the internal structure of disordered and partially ordered systems. In the 1960s, the method became increasingly important in the study of biological macromolecules in solution as it allowed one to get low resolution structural information on the overall shape and internal structure in the absence of crystals. A breakthrough in SAXS and SANS experiments came in the 1970s, thanks to the availability of synchrotron radiation and neutron sources, the latter paving the way for contrast variation by solvent exchange of H2O for D2O and specific deuteration methods. It was realised that scattering studies on solution provide, at a minimal investment of time and effort, useful insights into the structure of non crystalline biochemical systems. Moreover, SAXS/SANS also made possible real time investigations of intermolecular interactions, including assembly and large scale conformational changes in macromolecular assemblies. The main difficulty of SAS as a structural method is to extract the three dimensional structural information of the object from the one dimensional experimental data. In the past, only overall particle parameters (e. g. volume, radius of gyration) of the macromolecules were directly determined from the experimental data, whereas the analysis in terms of three dimensional models was limited to simple geometrical bodies (e. g. ellipsoids, cylinders, etc.) or was performed on an ad hoc trial and error basis. Electron microscopy was often used as a constraint in building consensus models. In the 1980s, progress in other structural methods led to a decline of the interest of biochemists in SAS studies, which drew structural conclusions from just a couple of overall parameters or were based on trial and error models. The 1990s brought a breakthrough in SAXS/SANS data analysis methods, which opened the way for reliable ab initio modelling of macromolecular complexes, including detailed determination of shape and domain structure and application of rigid body refinement techniques. This progress was accompanied by further advances in instrumentation, allowing sub ms time resolutions to be achieved on third generation SR sources in the studies of protein and nucleic acid folding.

Анализ данных

В хорошо спланированном эксперименте SAS измеряется несколько растворов с различными концентрациями исследуемой макромолекулы. Экстраполируя кривые рассеяния, измеренные при разных концентрациях, до нулевой концентрации, можно получить кривую рассеяния, соответствующую бесконечному разбавлению. В этом случае эффекты концентрации не должны влиять на кривую рассеяния. Анализ данных экстраполированной кривой рассеяния начинается с изучения начала кривой в области около s = 0. Если эта область подчиняется приближению Гвинея (также известному как закон Гвинея), это указывает на отсутствие агрегации в образце. Затем форму частицы можно определить различными методами, некоторые из которых описаны в указанной ссылке. Было показано, что при определенных условиях из данных рассеяния можно выделить уникальную огибающую. Этот метод применим только к глобулярным частицам относительно простой формы и без значительных внутренних полостей. Для преодоления этих ограничений был разработан альтернативный подход, использующий различные типы поиска методом Монте-Карло. DALAI GA – это элегантная программа, которая берет сферу диаметром, равным максимальному размеру частиц Dmax, определяемому по данным рассеяния, и заполняет ее сферическими элементами (бусинами). Каждая бусина принадлежит либо частице (индекс = 1), либо растворителю (индекс = 0). Таким образом, форма описывается двоичной строкой длиной M. Начиная со случайной строки, генетический алгоритм ищет модель, соответствующую экспериментальным данным. В процессе поиска, реализованном в программе DAMMIN, накладываются ограничения на компактность и связность. Если известна симметрия частицы, SASHA и DAMMIN могут использовать эту информацию в качестве полезного ограничения. Методика SAXS3D "give-and-take" и программа SASMODEL, основанная на взаимосвязанных эллипсоидах, являются ab initio методами Монте-Карло, не имеющими ограничений в пространстве поиска. Для аппроксимации кривых рассеяния белков с несколькими доменами и макромолекулярных комплексов также можно использовать модели, построенные на основе структур с высоким разрешением (ЯМР или рентгеновской дифракции) отдельных доменов или субъединиц, при условии сохранения их третичной структуры. В зависимости от сложности объекта для глобального поиска оптимальной конфигурации субъединиц, соответствующей экспериментальным данным, применяются различные подходы.

In a good quality SAS experiment, several solutions with different concentrations of the macromolecule under investigation are measured. By extrapolating the scattering curves measured at varying concentrations to zero concentration, one is able to get a scattering curve that represents infinite dilution. Then concentration effects should not affect the scattering curve. Data analysis of the extrapolated scattering curve begins with the inspection of the start of the scattering curve in the region around s = 0. If the region follows the Guinier approximation (also known as Guinier law), the sample is not aggregated. Then the shape of the particle in question can be determined by various methods, of which some are described in the following reference. It was demonstrated that under certain circumstances a unique envelope can be extracted from the scattering data. This method is only applicable to globular particles with relatively simple shapes and without significant internal cavities. To overcome these limitations, there was another approach developed, which uses different types of Monte Carlo searches. DALAI GA is an elegant program, which takes a sphere with diameter equal to the maximum particle size Dmax, which is determined from the scattering data, and fills it with beads. Each bead belongs either to the particle (index=1) or to the solvent (index=0). The shape is thus described by the binary string of length M. Starting from a random string, a genetic algorithm searches for a model that fits the data. Compactness and connectivity constrains are imposed in the search, implemented in the program DAMMIN. If the particle symmetry is known, SASHA and DAMMIN can utilise it as useful constraints. The 'give n take' procedure SAXS3D and the program SASMODEL, based on interconnected ellipsoids are ab initio Monte Carlo approaches without limitation in the search space. Solution scattering patterns of multi domain proteins and macromolecular complexes can also be fitted using models built from high resolution (NMR or X ray) structures of individual domains or subunits assuming that their tertiary structure is preserved. Depending on the complexity of the object, different approaches are employed for the global search of the optimum configuration of subunits fitting the experimental data.

Модель консенсуса

Модели, основанные на методе Монте-Карло, содержат сотни или тысячи параметров, поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать излишней интерпретации. Распространенный подход заключается в совместной обработке набора моделей, полученных в результате независимых запусков реконструкции формы, для создания усредненной модели, сохраняющей наиболее устойчивые и, следовательно, вероятно, наиболее достоверные характеристики (например, с использованием программы SUPCOMB).

Добавление недостающих циклов

Нарушенные поверхностные аминокислоты ("петли") часто не обнаруживаются в исследованиях ЯМР и кристаллографии и могут отсутствовать в представленных моделях. Такие неупорядоченные элементы вносят вклад в интенсивность рассеяния, и их вероятное местоположение можно определить, фиксируя известную часть структуры и добавляя недостающие фрагменты для соответствия SAS-паттерну от всей частицы. Подход с использованием "фиктивных остатков" был расширен, а алгоритмы для добавления отсутствующих петель или доменов были реализованы в программном пакете CREDO и методах de novo прогнозирования структуры белка. Данные SAXS предоставляют преобразование Фурье гистограммы расстояний между атомами (функция парного распределения) для данного белка. Это может служить структурным ограничением для методов, используемых для определения нативной конформационной организации белка. Метод поиска гомологов или распознавания структуры предполагает, что трехмерная структура более консервативна, чем последовательность. Таким образом, сильно различающиеся последовательности могут иметь схожую структуру. Методы ab initio, с другой стороны, решают одну из самых сложных задач в молекулярной биологии, а именно, предсказание сворачивания белка "с нуля", без использования гомологичных последовательностей или структур. Используя "SAXS-фильтр", авторы смогли значительно сократить набор моделей белка, полученных de novo. Другой пример демонстрирует, как данные SAXS можно объединить с данными ЯМР, рентгеновской кристаллографии и электронной микроскопии для реконструкции четвертичной структуры многодоменного белка.

Гибкие системы

Недавно был предложен элегантный метод решения проблемы внутренне неупорядоченных или многодоменных белков с гибкими линкерами. Он позволяет сосуществовать различным конформациям белка, которые в совокупности формируют среднюю экспериментальную картину рассеяния. Сначала EOM (метод оптимизации ансамбля) генерирует пул моделей, охватывающих пространство конфигураций белка. Затем для каждой модели рассчитывается кривая рассеяния. На втором этапе программа выбирает подмножества моделей белка. Для каждого подмножества рассчитывается среднее экспериментальное рассеяние и выполняется подгонка к экспериментальным данным SAXS. Если наилучшая подгонка не найдена, модели перераспределяются между различными подмножествами, и выполняется новый расчет среднего рассеяния и подгонка к экспериментальным данным. Этот метод был протестирован на двух белках – денатурированном лизоциме и протеинкиназе Брутона. Результаты оказались интересными и перспективными.