Введение
Вид бактерии
Legionella pneumophila – это аэробная, плеоморфная, жгутиковая, не образующая спор, грамотрицательная бактерия рода Legionella. L. pneumophila является основным патогеном для человека в роде Legionella. В природе L. pneumophila инфицирует почвенные амебы рода Acanthamoeba и пресноводные амебофлагелляты рода Naegleria. После первоначального открытия было установлено, что Legionella размножается внутри амеб и амебофлагеллят, что указывает на способность бактерий, размножающихся в экологических простейших, использовать сигнальные пути в макрофагах человека.
Характеристика
L. pneumophila – это коккобацилла. Это грамотрицательная, аэробная бактерия, не способная гидролизовать желатин или продуцировать уреазу. Она также не ферментирует. L. pneumophila не пигментирована и не обладает аутофлуоресценцией. Она положительна по оксидазе и каталазе и продуцирует бета-лактамазу. Морфология колоний L. pneumophila серо-белая, с текстурированной, "резного стекла" поверхностью; для роста ей также необходимы цистеин и железо. Она растет на агаре с экстрактом дрожжей, а также во влажной среде, такой как водопроводная вода, образуя колонии, напоминающие опал.
Структура клеточной мембраны
Хотя L. pneumophila классифицируется как грамотрицательный организм, он плохо окрашивается из-за уникального содержания липополисахаридов во внешнем слое внешней клеточной мембраны. Основы специфичности соматического антигена этого организма находятся в боковых цепях его клеточной стенки. Химический состав этих боковых цепей, как в отношении компонентов, так и в отношении расположения различных сахаров, определяет природу соматических или O-антигенных детерминант, которые являются важным средством серологической классификации многих грамотрицательных бактерий. Описано по крайней мере 35 различных сероваров L. pneumophila, а также несколько других видов, подразделенных на множество сероваров.
Экология и водоемы
L. pneumophila – это бактерия, которую можно обнаружить в самых разных условиях окружающей среды. Она может существовать при температурах от 0 до 63 °C, при pH от 5,0 до 8,5 и при уровне растворенного кислорода от 0,2 до 15,0 мг/л. В окружающей среде она встречается в пресноводных водоемах в этом широком диапазоне температур. Хотя она может присутствовать в более широком диапазоне, размножается она только при температуре от 25 до 42 °C. Основной источник загрязнения L. pneumophila – это системы водоснабжения, что способствует росту и распространению бактерии в таких местах, как градирни, водопроводные системы больниц, отелей и круизных лайнеров.
Биопленки
Биофильмы – это специализированные сообщества, прикрепляющиеся к поверхности, которые могут состоять из одного микроба или нескольких различных, включая бактерии, водоросли и простейшие. Биофильмы в системах водоснабжения и водораспределения являются местом, где может выжить большое количество L. pneumophila. Материал также играет роль в размножении биофильмов. В водопроводных трубах L. pneumophila чаще обнаруживается в пластиковых трубах при 40 °C, чем в медных, которые, напротив, подавляют рост. Эта бактерия может инфицировать и выживать внутри родов простейших, таких как Acanthamoeba, Vermamoeba и Naegleria. Находясь внутри клетки-хозяина, бактерии окружены устойчивой цистой, что позволяет им выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды, например, при воздействии хлора, который обычно используется в системах очистки воды. Хотя известно, что простейшие играют важную роль в экологии L. pneumophila, данных о том, как эти организмы взаимодействуют с другими микробами в окружающей среде и как это влияет на L. pneumophila в целом, немного. Примерно 2 человека на 100 000 заражаются каждый год в ЕС. L. pneumophila часто инфицирует людей через источники воды низкого качества. Около 20% зарегистрированных случаев болезни легионеров связаны с медицинскими учреждениями, домами престарелых или туристическими объектами, подвергшимися воздействию воды, загрязненной L. pneumophila. Несколько крупных вспышек болезни легионеров произошли в общественных джакузи из-за того, что температурный режим воды оказался идеальным для роста легионелл.
Патогенез
У людей L. pneumophila проникает внутрь и размножается в макрофагах. Интернализация бактерий может усиливаться присутствием антител и комплемента, но не является абсолютно необходимой. Поглощение бактерий, по-видимому, происходит посредством фагоцитоза. Однако L. pneumophila также способен инфицировать нефагоцитарные клетки посредством неизвестного механизма. Для L. pneumophila описана редкая форма фагоцитоза, известная как спиральный фагоцитоз, но она не зависит от бактериальной системы секреции Dot/Icm (дефект в транспорте органелл/генах внутриклеточного размножения) и наблюдалась у других патогенов. После интернализации система Dot/Icm начинает секретировать бактериальные эффекторные белки, которые рекрутируют факторы хозяина к вакуоли, содержащей легионеллы (LCV), трансформируя мембрану до состояния, неразличимого с мембраной эндоплазматической сети. Этот процесс предотвращает слияние LCV с лизосомами, которые в противном случае разрушили бы бактерии. Именно внутри LCV происходит репликация бактерий. Для поддержания целостности мембраны LCV требуется постоянное поступление липидов от хозяина. Исследования показали, что клеточный холестерин и цис-мононенасыщенная жирная кислота, пальмитолеиновая кислота, являются важными липидами, получаемыми от хозяина, которые способствуют расширению мембраны LCV.
Факторы вирулентности
L. pneumophila обладает уникальной липополисахаридной (LPS) структурой, отличающейся высокой гидрофобностью из-за плотного расположения разветвленных жирных кислот и повышенного содержания O-ацетил- и N-ацетил-групп. Эта структура препятствует взаимодействию с общим корецептором иммунной системы для LPS, CD14. L. pneumophila имеет единственный полярный жгутик, который используется для подвижности клеток, адгезии, инвазии в клетки хозяина и образования биопленок. Белки, необходимые для этих процессов, секретируются системой транслокации Dot/Icm, чтобы нарушать клеточные процессы хозяина и способствовать выживанию бактерий. Предполагается, что род Legionella кодирует более 10 000 и, возможно, до ~18 000 эффекторов, которые с высокой вероятностью секретируются в клетки хозяина. Один из основных механизмов действия эффекторных белков L. pneumophila заключается во вмешательстве в слияние вакуоли, содержащей Legionella, с эндосомами хозяина, тем самым защищая бактерию от лизиса. Исследования нокаутов эффекторов, транслоцируемых системой Dot/Icm, показали, что они необходимы для внутриклеточного выживания бактерии, однако считается, что многие отдельные эффекторные белки функционируют избыточно, поскольку нокаут одного гена эффектора редко существенно влияет на внутриклеточное выживание. Вероятно, такое большое количество транслоцируемых эффекторных белков и их избыточность являются следствием эволюции бактерии в различных хозяевах-протозоах.
Вакуолы, содержащие легионеллы
Для выживания внутри макрофагов и простейших легионелле необходимо создать специализированное компартмент, известный как вакуоль, содержащая легионеллу (LCV). Благодаря функционированию системы секреции Dot/Icm, бактерии способны предотвратить деградацию посредством обычного эндосомного трафика и вместо этого реплицироваться. Вскоре после интернализации бактерии специфически рекрутируют везикулы, происходящие из эндоплазматической сети, и митохондрии к LCV, одновременно предотвращая рекрутирование эндосомных маркеров, таких как Rab5a и Rab7a. Формирование и поддержание вакуолей критически важны для патогенеза; бактерии, лишенные системы секреции Dot/Icm, непатогенны и не способны реплицироваться внутри клеток, в то время как делеция эффектора Dot/Icm SdhA приводит к дестабилизации мембраны вакуоли и отсутствию репликации бактерий.
Метаболизм
L. pneumophila использует гликолиз, путь Эннера — Додоффа (ED), путь пентозофосфата (PP) и цикл трикарбоновых кислот (TCA). Хотя L. pneumophila также способна к глюконеогенезу, у неё отсутствуют гены, кодирующие 1,6-бисфосфатазы. Следовательно, для завершения глюконеогенеза используются другие ферменты. Один из таких ферментов — фруктозо-6-фосфатальдолаза. Это приводит к избытку свободных аминокислот в цитоплазме инфицированных клеток L. pneumophila, которые могут быть использованы для внутривакуолярной пролиферации паразита. Полиубиквитинирование, связанное с K48, является маркером протеасомной деградации, высвобождающим пептиды длиной от 2 до 24 аминокислот, которые быстро расщепляются до аминокислот различными олигопептидазами и аминопептидазами, присутствующими в цитоплазме. Аминокислоты импортируются в LCV через различные аминокислотные транспортеры, такие как нейтральный аминокислотный транспортер B(0). Однако стимуляция протеасомной деградации для получения аминокислот и гидролиз полисахаридов могут быть не единственными факторами вирулентности, обеспечивающими получение углерода и источников энергии от хозяина. Деградативные ферменты типа II могут представлять собой дополнительную стратегию для получения углерода и источников энергии. L. pneumophila — единственный известный внутриклеточный патоген, обладающий системой секреции типа II (секретомом). При секреции типа II белки сначала транслоцируются через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. Этот процесс опосредован либо путем Sec, либо путем Tat. Вскоре после этого те же белки транспортируются через специфическое отверстие во внешней мембране наружу клетки. Считается, что в секретом содержится до 60 белков, включенных в систему. Эти четыре штамма имеют схожий размер: штамм Lens — около 3,3 Мб, а штаммы Paris и Corby — около 3,5 Мб. Больший размер отражает большее количество генов, что соответствует способности Legionella адаптироваться к различным хозяевам и условиям окружающей среды. Во всех четырех штаммах L. pneumophila наблюдается относительно высокое содержание эукариотических белков (ELP), что позволяет предположить, что эти ELP полезны для их повседневной функции. Фактически, считается, что многие из этих ELP приносят пользу патогену, модулируя клетки хозяина. Углубленный сравнительный анализ генома с использованием ДНК-микроматриц для изучения геномного содержания 180 штаммов Legionella выявил высокую геномную пластичность и частые события горизонтального переноса генов. Дополнительные сведения о жизненном цикле L. pneumophila были получены путем изучения профиля экспрессии генов L. pneumophila у Acanthamoeba castellanii, распространенного вида хозяина. L. pneumophila демонстрирует двухфазный жизненный цикл и определяет трансмиссивные и репликативные признаки в соответствии с профилями экспрессии генов. Для связывания, поглощения и рекомбинации экзогенной ДНК в свою хромосому бактерии необходимо войти в особое физиологическое состояние, называемое «компетентностью». Для определения молекул, которые могут индуцировать компетентность у L. pneumophila, было протестировано 64 токсичных молекулы. Только шесть из этих молекул, все из которых повреждают ДНК, вызвали сильную индукцию компетентности. Это митомицин С (вводит межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксиновая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие разрывы двойных цепей), бицикломицин (вызывает разрывы двойных цепей) и гидроксимочевина (вызывает окисление оснований ДНК). Эти результаты позволяют предположить, что компетентность к трансформации у L. pneumophila развилась в ответ на повреждение ДНК. Кроме того, изучен cN II класс IMP/GMP-специфической 5'-нуклеотидазы, кинетические характеристики которой были подробно охарактеризованы. Тетрамерный фермент проявляет признаки положительной гомотропной кооперативности, активации субстрата и содержит уникальный аллостерический сайт, который можно использовать для разработки эффективных лекарств против фермента и, следовательно, организма. Более того, фермент отличается от своего человеческого аналога, что делает его привлекательной мишенью для разработки лекарств.
Выявление и лечение
Антисыворотки использовались как для проведения реакции склеивания на стекле, так и для непосредственного обнаружения бактерий в тканях с помощью иммунофлуоресценции посредством флуоресцентно меченных антител. Специфические антитела у пациентов можно определить с помощью непрямой реакции флуоресцентной антителами. Также успешно применялись методы ELISA и микроагглютинации. Легионелла плохо окрашивается по Граму, хорошо окрашивается серебром и культивируется на среде с активированным углем, экстрактом дрожжей, железом и цистеином. Стандартным методом диагностики заболевания является определение антигена в моче. Не выявлено значимой разницы в эффективности лечения легионеллезной пневмонии фторхинолонами или азитромицином. Левофлоксацин и азитромицин обладают выраженной внутриклеточной активностью и способны проникать в клетки, инфицированные Legionella. Инфекционное общество Америки рекомендует лечение левофлоксацином в течение 5–10 дней или азитромицином в течение 3–5 дней, однако пациентам с иммунодефицитом или тяжелым течением заболевания может потребоваться более продолжительный курс терапии.