Морфолиновые олигомеры: структура, применение и перспективы в медицине.

Введение

Химическое соединение

Морфолино, также известное как олигомер морфолино и как олигомер фосфородиамидата морфолино (PMO), является типом олигомерной молекулы (в разговорной речи – олиго), используемой в молекулярной биологии для модификации экспрессии генов. Его молекулярная структура содержит основания ДНК, присоединенные к цепи из метиленморфолиновых колец, связанных через фосфородиамидатные группы. Морфолины блокируют доступ других молекул к небольшим (~25 оснований) специфическим последовательностям на участках спаривания оснований рибонуклеиновой кислоты (РНК). Морфолины используются в качестве исследовательских инструментов в обратной генетике для подавления функции генов. В данной статье рассматриваются только антисмысловые олигомеры морфолино, которые являются аналогами нуклеиновых кислот. Слово «морфолино» может встречаться в других химических названиях, относящихся к веществам, содержащим шестичленное морфолиновое кольцо. Чтобы избежать путаницы с другими молекулами, содержащими морфолин, при описании олигомеров «Morpholino» часто пишется с большой буквы как торговое название, хотя эта практика непоследовательна в научной литературе. Олигомеры морфолино иногда называют PMO (фосфородиамидатный олигомер морфолино), особенно в медицинской литературе. Vivo Morpholinos и PPMO – это модифицированные формы морфолино, к которым ковалентно присоединены химические группы для облегчения проникновения в клетки. Подавление функции гена достигается за счет снижения экспрессии конкретного гена в клетке. В случае генов, кодирующих белки, это обычно приводит к уменьшению количества соответствующего белка в клетке. Подавление экспрессии генов – это метод изучения функции конкретного белка; аналогичным образом, исключение конкретного экзона из РНК-транскрипта, кодирующего белок, может помочь определить функцию белковой части, кодируемой этим экзоном, или иногда полностью подавить активность белка. Эти молекулы применялись в исследованиях на различных модельных организмах, включая мышей, данио-рерио, лягушек и морских ежей. Морфолины также могут модифицировать сплайсинг пре-мРНК или ингибировать созревание и активность микроРНК (миРНК). Методы нацеливания морфолинов на РНК и доставки морфолинов в клетки недавно были рассмотрены в научной статье и в книге. Морфолины разрабатываются в качестве фармацевтических препаратов для лечения патогенных организмов, таких как бактерии или вирусы, и генетических заболеваний. Препарат eteplirsen на основе морфолино от компании Sarepta Therapeutics получил ускоренное одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в сентябре 2016 года для лечения некоторых мутаций, вызывающих мышечную дистрофию Дюшенна, хотя процесс одобрения сопровождался спорами. Другие препараты на основе морфолино – голодирсен, вилтоларсен и казимерсен (также для мышечной дистрофии Дюшенна) были одобрены FDA в 2019–2021 годах.

A Morpholino, also known as a Morpholino oligomer and as a phosphorodiamidate Morpholino oligomer (PMO), is a type of oligomer molecule (colloquially, an oligo) used in molecular biology to modify gene expression. Its molecular structure contains DNA bases attached to a backbone of methylenemorpholine rings linked through phosphorodiamidate groups. Morpholinos block access of other molecules to small (~25 base) specific sequences of the base pairing surfaces of ribonucleic acid (RNA). Morpholinos are used as research tools for reverse genetics by knocking down gene function. This article discusses only the Morpholino antisense oligomers, which are nucleic acid analogs. The word "Morpholino" can occur in other chemical names, referring to chemicals containing a six membered morpholine ring. To help avoid confusion with other morpholine containing molecules, when describing oligos "Morpholino" is often capitalized as a trade name, but this usage is not consistent across scientific literature. Morpholino oligos are sometimes referred to as PMO (for phosphorodiamidate morpholino oligomer), especially in medical literature. Vivo Morpholinos and PPMO are modified forms of Morpholinos with chemical groups covalently attached to facilitate entry into cells. Gene knockdown is achieved by reducing the expression of a particular gene in a cell. In the case of protein coding genes, this usually leads to a reduction in the quantity of the corresponding protein in the cell. Knocking down gene expression is a method for learning about the function of a particular protein; in a similar manner, causing a specific exon to be spliced out of the RNA transcript encoding a protein can help to determine the function of the protein moiety encoded by that exon or can sometimes knock down the protein activity altogether. These molecules have been applied to studies in several model organisms, including mice, zebrafish, frogs and sea urchins. Morpholinos can also modify the splicing of pre mRNA or inhibit the maturation and activity of miRNA. Techniques for targeting Morpholinos to RNAs and delivering Morpholinos into cells have recently been reviewed in a journal article and in book form. Morpholinos are in development as pharmaceutical therapeutics targeted against pathogenic organisms such as bacteria or viruses and genetic diseases. A Morpholino based drug eteplirsen from Sarepta Therapeutics received accelerated approval from the US Food and Drug Administration in September 2016 for the treatment of some mutations causing Duchenne muscular dystrophy, although the approval process was mired in controversy. Other Morpholino based drugs golodirsen, viltolarsen, and casimersen (also for Duchenne muscular dystrophy) were approved by the FDA in 2019–2021.

История

Олигоморфолины были задуманы Саммертоном (Gene Tools) в компании AntiVirals Inc. (ныне Sarepta Therapeutics) и первоначально разработаны в сотрудничестве с Уэллером.

Структура

Морфолины – это синтетические молекулы, являющиеся результатом перепроектирования структуры природных нуклеиновых кислот. Обычно длиной в 25 оснований, они связываются с комплементарными последовательностями РНК или одноцепочечной ДНК посредством стандартного спаривания нуклеотидных оснований. Структурно морфолины отличаются от ДНК тем, что, хотя и содержат стандартные нуклеотидные основания, эти основания связаны с метиленморфолиновыми кольцами через фосфородиамидатные группы вместо фосфатов. Олигоморфолины часто используются для изучения роли конкретного мРНК-транскрипта в эмбрионе. Специалисты в области биологии развития вводят олигоморфолины в яйца или эмбрионы данио-рерио (рыбы-зебры), африканской когтистой лягушки (Xenopus), морского ежа и киллифиша (F. heteroclitus), получая эмбрионы-морфанты, или электропорируют морфолины в эмбрионы цыплят на более поздних стадиях развития. При наличии подходящих систем доставки в цитозоль, морфолины эффективны в клеточных культурах. Морфолины Vivo, в которых олигомер ковалентно связан с дендримером-переносчиком, проникают в клетки при системном введении взрослым животным или в тканевых культурах.

Нормальная экспрессия генов у эукариотов

В эукариотических организмах пре-мРНК транскрибируется в ядре, интроны вырезаются, после чего зрелая мРНК экспортируется из ядра в цитоплазму. Малая субъединица рибосомы обычно начинает связывание с 5'-концом мРНК, к которому присоединяются различные эукариотические факторы инициации, формируя инициационный комплекс. Этот комплекс сканирует молекулу мРНК до тех пор, пока не достигнет стартового кодона, после чего к малой субъединице присоединяется большая субъединица рибосомы и начинается трансляция белка. Весь этот процесс называется экспрессией гена; это процесс, посредством которого информация, закодированная в гене в виде последовательности нуклеотидов ДНК, преобразуется в структуру белка. Морфолино может изменять сплайсинг, блокировать трансляцию или блокировать другие функциональные участки РНК, в зависимости от последовательности оснований самого морфолино.

Блокировка перевода

Присоединяясь к 5'-нетранслируемой области мРНК, морфолины могут препятствовать продвижению комплекса инициации рибосомы от 5'-кэпа к стартовому кодону. Это предотвращает трансляцию кодирующей области целевого транскрипта (процесс, называемый "подавлением" экспрессии гена). Это полезно в экспериментах, когда исследователю необходимо выяснить функцию конкретного белка; морфолины предоставляют удобный способ подавить экспрессию белка и изучить, как это подавление влияет на клетки или организм. Некоторые морфолины подавляют экспрессию настолько эффективно, что после деградации уже существующих белков целевые белки становятся необнаружимыми при вестерн-блоттинге. В 2016 году было обнаружено, что синтетический пептидный конъюгат ПМО (ППМО) ингибирует экспрессию металло-бета-лактамазы Нью-Дели, фермента, который многие лекарственно-устойчивые бактерии используют для разрушения карбапенемов.

Модификация пре-мРНК сплайсинга

Морфолины могут вмешиваться в этапы обработки пре-мРНК, либо предотвращая связывание комплексов малых ядерных рибонуклеопротеинов, направляющих сплайс (snRNP), с их мишенями на границах интронов на нити пре-мРНК, либо блокируя нуклеофильное адениновое основание и препятствуя образованию структуры сплайс-лариата, либо вмешиваясь в связывание белков, регулирующих сплайс, таких как ингибиторы сплайса и активаторы сплайса. Предотвращение связывания snRNP U1 (на донорном сайте) или U2/U5 (на полипиримидиновом участке и сайте акцептора) может вызывать модифицированный сплайсинг, обычно приводящий к исключению экзонов из зрелой мРНК. Нацеливание на некоторые сплайс-мишени приводит к включению интронов, в то время как активация криптических сайтов сплайса может приводить к частичному включению или исключению. Мишени snRNP U11/U12 также могут быть заблокированы. Модификацию сплайса можно удобно оценить с помощью обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) и наблюдать как сдвиг полосы после электрофореза в геле продуктов RT-PCR. Морфолины могут блокировать активность рибозимов. Функции snRNP U2 и U12 были ингибированы морфолинами. Морфолины, нацеленные на "скользкие" последовательности мРНК в кодирующих областях белка, могут индуцировать трансляционные сдвиги рамки считывания. Морфолины могут блокировать редактирование РНК, полиаденилирование и транслокационные последовательности. Активность морфолинов в отношении такого разнообразия мишеней позволяет предположить, что морфолины могут использоваться в качестве универсального инструмента для блокирования взаимодействия белков или нуклеиновых кислот с мРНК.

Специфика, стабильность и неантисенсовые эффекты

Морфолины стали стандартным инструментом для подавления экспрессии генов в эмбриональных системах животных, которые характеризуются более широким диапазоном экспрессии генов, чем во взрослых клетках, и могут быть сильно подвержены нецелевым взаимодействиям. После первоначальной инъекции в эмбрионы лягушек или рыб на одноклеточной или немногоклеточной стадии эффекты морфолинов можно измерить до пяти дней спустя, после завершения большинства процессов органогенеза и дифференцировки, с наблюдаемыми фенотипами, соответствующими подавлению экспрессии целевого гена. Контрольные олигонуклеотиды с нерелевантными последовательностями обычно не вызывают изменений в эмбриональном фенотипе, что свидетельствует о специфичности последовательности олигонуклеотида морфолина и отсутствии неантисенсовых эффектов. Дозу, необходимую для подавления экспрессии, можно снизить путем коинъекции нескольких олигонуклеотидов морфолина, нацеленных на одну и ту же мРНК, что является эффективной стратегией для уменьшения или устранения дозозависимых нецелевых взаимодействий с РНК. Эксперименты по спасению с помощью мРНК иногда могут восстановить фенотип дикого типа в эмбрионах и предоставить доказательства специфичности морфолина. При спасении с помощью мРНК морфолин коинъецируется с мРНК, кодирующей белок, на который нацелен морфолин. Однако спасательная мРНК имеет модифицированный 5'-UTR (непереведенную область), так что она не содержит мишени для морфолина. Кодирующая область спасательной мРНК кодирует интересующий белок. Трансляция спасательной мРНК замещает производство белка, экспрессия которого была подавлена морфолином. Поскольку спасательная мРНК не повлияет на фенотипические изменения, вызванные модуляцией экспрессии генов морфолином вне целевого участка, возвращение к фенотипу дикого типа является дополнительным доказательством специфичности морфолина. Благодаря полностью неестественному составу морфолины не распознаются клеточными белками. Нуклеазы не разрушают морфолины, и они не подвергаются деградации в сыворотке или в клетках. До 18% морфолинов, по-видимому, индуцируют нецелевые фенотипы, включая гибель клеток в центральной нервной системе и сомитных тканях эмбрионов зебра. Большинство этих эффектов обусловлены активацией апоптоза, опосредованного p53, и могут быть подавлены коинъекцией анти-p53 морфолина вместе с экспериментальным морфолином. Кроме того, апоптотический эффект, опосредованный p53, был воспроизведен с использованием другого антисмыслового структурного типа, что указывает на то, что апоптоз, опосредованный p53, является следствием потери целевого белка, а не следствием типа подавляющего олигонуклеотида. Похоже, что эти эффекты специфичны для последовательности; в большинстве случаев, если морфолин связан с нецелевыми эффектами, морфолин с 4-базовым несовпадением не вызовет эти эффекты. Потенциал "нецелевых" эффектов вызывает опасения при использовании морфолинов. Можно определить, является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом намеренного подавления экспрессии генов или взаимодействия с нецелевой РНК, проведя дополнительный эксперимент для подтверждения того, что наблюдаемый фенотип морфанта является результатом подавления экспрессии ожидаемой мишени. Это можно сделать, воспроизведя фенотип морфанта с помощью второго, не перекрывающегося морфолина, нацеленного на ту же мРНК. Альтернативным методом доставки в эмбрионах является электропорация, которая может доставлять олигонуклеотиды в ткани на более поздних стадиях эмбрионального развития. Распространенные методы доставки в культивируемые клетки включают пептид Endo-Porter (который вызывает высвобождение морфолина из эндосом) или скребок. Доставка в взрослые ткани обычно затруднена, хотя существует несколько систем, позволяющих эффективное поглощение немодифицированных олигонуклеотидов морфолина (включая поглощение в мышечные клетки при мышечной дистрофии Дюшенна или в сосудистые эндотелиальные клетки, подвергшиеся стрессу во время баллонной ангиопластики). Хотя они эффективно проникают через межклеточные пространства в тканях, неконъюгированные PMO имеют ограниченное распределение в цитозоле и ядерном пространстве здоровых тканей после внутривенного введения. Системная доставка во многие клетки взрослых организмов может быть достигнута с помощью ковалентных конъюгатов олигонуклеотидов морфолина с пептидами, проникающими в клетки, и, хотя токсичность связана с умеренными дозами пептидных конъюгатов, они были использованы in vivo для эффективной доставки олигонуклеотидов при дозах, не вызывающих наблюдаемой токсичности. Октагуанидиниумный дендример, присоединенный к концу морфолина, может доставлять модифицированный олигонуклеотид (называемый Vivo Morpholino) из крови в цитозоль. Морфолины с улучшенной доставкой, такие как пептидные конъюгаты и Vivo Morpholino, перспективны в качестве терапевтических средств для вирусных и генетических заболеваний.

Morpholinos have become a standard knockdown tool in animal embryonic systems, which have a broader range of gene expression than adult cells and can be strongly affected by an off target interaction. Following initial injections into frog or fish embryos at the single cell or few cell stages, Morpholino effects can be measured up to five days later, after most of the processes of organogenesis and differentiation are past, with observed phenotypes consistent with target gene knockdown. Control oligos with irrelevant sequences usually produce no change in embryonic phenotype, evidence of the Morpholino oligo's sequence specificity and lack of non antisense effects. The dose required for a knockdown can be reduced by coinjection of several Morpholino oligos targeting the same mRNA, which is an effective strategy for reducing or eliminating dose dependent off target RNA interactions. mRNA rescue experiments can sometimes restore the wild type phenotype to the embryos and provide evidence for the specificity of a Morpholino. In an mRNA rescue, a Morpholino is co injected with an mRNA that codes for the morphlino's protein. However, the rescue mRNA has a modified 5' UTR (untranslated region) so that the rescue mRNA contains no target for the Morpholino. The rescue mRNA's coding region encodes the protein of interest. Translation of the rescue mRNA replaces production of the protein that was knocked down by the Morpholino. Since the rescue mRNA would not affect phenotypic changes due to the Morpholino's off target gene expression modulation, this return to wild type phenotype is further evidence of Morpholino specificity. Because of their completely unnatural backbones, Morpholinos are not recognized by cellular proteins. Nucleases do not degrade Morpholinos, nor are they degraded in serum or in cells. Up to 18% of Morpholinos appear to induce nontarget related phenotypes including cell death in the central nervous system and somite tissues of zebrafish embryos. Most of these effects are due to activation of p53 mediated apoptosis and can be suppressed by co injection of an anti p53 Morpholino along with the experimental Morpholino. Moreover, the p53 mediated apoptotic effect of a Morpholino knockdown has been phenocopied using another antisense structural type, showing the p53 mediated apoptosis to be a consequence of the loss of the targeted protein and not a consequence of the knockdown oligo type. It appears that these effects are sequence specific; as in most cases, if a Morpholino is associated with non target effects, the 4 base mismatch Morpholino will not trigger these effects. A cause for concern in the use of Morpholinos is the potential for "off target" effects. Whether an observed morphant phenotype is due to the intended knockdown or an interaction with an off target RNA can often be addressed in embryos by running another experiment to confirm that the observed morphant phenotype results from the knockdown of the expected target. This can be done by recapitulating the morphant phenotype with a second, non overlapping Morpholino targeting the same mRNA, an alternative method for embryonic delivery is electroporation, which can deliver oligos into tissues of later embryonic stages. Common techniques for delivery into cultured cells include the Endo Porter peptide (which causes the Morpholino to be released from endosomes), or scrape loading. Delivery into adult tissues is usually difficult, though there are a few systems allowing useful uptake of unmodified Morpholino oligos (including uptake into muscle cells with Duchenne muscular dystrophy or the vascular endothelial cells stressed during balloon angioplasty). Though they permeate through intercellular spaces in tissues effectively, unconjugated PMOs have limited distribution into the cytosol and nuclear spaces within healthy tissues following IV administration. Systemic delivery into many cells in adult organisms can be accomplished by using covalent conjugates of Morpholino oligos with cell penetrating peptides, and, while toxicity has been associated with moderate doses of the peptide conjugates, they have been used in vivo for effective oligo delivery at doses below those causing observed toxicity. An octa guanidinium dendrimer attached to the end of a Morpholino can deliver the modified oligo (called a Vivo Morpholino) from the blood to the cytosol. Delivery enabled Morpholinos, such as peptide conjugates and Vivo Morpholinos, show promise as therapeutics for viral and genetic diseases.