Введение

Бактериологическая техника

Окраска по Цилю-Нильсену, также известная как окраска кислотоустойчивых бактерий, является бактериологической техникой окрашивания, используемой в цитопатологии и микробиологии для идентификации кислотоустойчивых бактерий под микроскопом, особенно представителей рода Mycobacterium. Этот метод окрашивания был впервые предложен Полом Эрлихом (1854–1915) и впоследствии модифицирован немецкими бактериологами Францем Зилем (1859–1926) и Фридрихом Нильсеном (1854–1898) в конце XIX века. Метод окрашивания кислотоустойчивых бактерий, в сочетании с окрашиванием аурамин-фенолом, служит стандартным диагностическим инструментом и широко доступен для быстрой диагностики туберкулеза (вызываемого Mycobacterium tuberculosis) и других заболеваний, вызываемых атипичными микобактериями, таких как лепра (проказа, вызываемая Mycobacterium leprae) и инфекция, вызванная Mycobacterium avium intracellulare (вызываемая комплексом Mycobacterium avium), в образцах, таких как мокрота, промывные воды желудка и бронхоальвеолярный лаваж. Эти кислотоустойчивые бактерии обладают воскообразным, богатым липидами внешним слоем, содержащим высокие концентрации миколевой кислоты, что делает их устойчивыми к традиционным методам окрашивания, таким как окраска по Граму. После процедуры окрашивания по Цилю-Нильсену с использованием карболфуксина, кислотоустойчивые бактерии видны как яркие красные или розовые палочки на синем или зеленом фоне, в зависимости от используемого противоокрашивающего вещества, например, метиленового синего или малахитового зеленого, соответственно. Некислотоустойчивые бактерии и другие клеточные структуры окрашиваются противоокрашивающим веществом, что обеспечивает четкую дифференциацию.

Микобактерии

В анатомических патологических образцах иммуногистохимия и модификации окраски по Цилю-Нильсену (такие как окраска по Фите-Фарако) обладают сопоставимой диагностической ценностью при идентификации микобактерий. Оба метода превосходят традиционную окраску по Цилю-Нильсену. Микобактерии – это медленно растущие палочковидные бактерии, слегка изогнутые или прямые, и считаются грамположительными. Некоторые микобактерии являются свободноживущими сапрофитами, но многие – патогены, вызывающие заболевания у животных и человека. *Mycobacterium bovis* вызывает туберкулез у крупного рогатого скота. Поскольку туберкулез может передаваться людям, молоко пастеризуют для уничтожения бактерий. *Mycobacterium tuberculosis*, вызывающая туберкулез (ТБ) у людей, – это воздушно-капельная инфекция, которая обычно поражает легкие. Диагностика ТБ включает анализы крови, кожные пробы и рентген грудной клетки. При исследовании мазков для диагностики ТБ их окрашивают кислотоустойчивой окраской. Эти кислотоустойчивые микроорганизмы, такие как микобактерии, содержат большое количество липидных веществ в клеточной стенке, называемых миколиновыми кислотами. Эти кислоты устойчивы к окрашиванию обычными методами, например, по Граму. Окраска также может применяться для некоторых других бактерий, таких как *Nocardia*. Реагенты, используемые для окраски по Цилю-Нильсену, включают карболфуксин, кислотный спирт и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии после окрашивания приобретают ярко-красный цвет.

Грибки

Окраска по Цилю-Нильсену – это вид грибкового красителя узкого спектра. Красители грибков узкого спектра являются селективными и могут помочь в дифференциации и идентификации грибков. Результаты окраски по Цилю-Нильсену могут быть различными, поскольку клеточные стенки многих грибков не являются кислотоустойчивыми. Примером распространенного типа кислотоустойчивого грибка, который обычно окрашивается по Цилю-Нильсену, является гистоплазма (ГП). Гистоплазма встречается в почве и фекалиях птиц и летучих мышей. Люди могут заразиться гистоплазмозом при вдыхании грибковых спор. Гистоплазма проникает в организм и достигает легких, где споры превращаются в дрожжи. Дрожжи попадают в кровоток и поражают лимфатические узлы и другие части тела. Обычно люди не заболевают при вдыхании спор, но если заболевают, то обычно испытывают симптомы, похожие на грипп. Другая вариация этого метода окрашивания используется в микологии для дифференциального окрашивания кислотоустойчивых инкрустаций в кутикулярных гифах некоторых видов грибов рода *Russula*. Некоторые свободные эндоспоры могут быть спутаны с мелкими дрожжами, поэтому окрашивание используется для идентификации неизвестных грибков. Оно также полезно для идентификации некоторых простейших, в частности *Cryptosporidium* и *Isospora*. Окраска по Цилю-Нильсену также может затруднить диагностику при парагонимозе, поскольку яйца в образце мокроты для исследования на яйца и паразитов (O&P) могут быть растворены красителем, и она часто используется в этой клинической ситуации, поскольку признаки и симптомы парагонимоза тесно напоминают симптомы…

История

В 1882 году Роберт Кох установил этиологию туберкулеза. Вскоре после открытия Коха Пол Эрлих разработал метод окрашивания микобактерий туберкулеза, получивший название окраска алюминиевым гематоксилином. Франц Зиль затем модифицировал технику окрашивания Эрлиха, используя карболовую кислоту в качестве фиксатора. Фридрих Нильсен сохранил выбор фиксатора Зиля, но заменил основной краситель на карболфуксин. Совместные модификации Зиля и Нильсена привели к разработке метода окрашивания по Зилю-Нильсену. Другой метод окрашивания кислотоустойчивых бактерий был разработан Джозефом Киньюном на основе метода Зиля-Нильсена, но без этапа нагревания. Этот новый метод окрашивания, разработанный Киньюном, получил название окраска по Киньюну.

Объяснение механизма

Механизм действия красителя Циля-Нильсена не полностью изучен, но считается, что он включает в себя химическую реакцию между кислыми красителями и клеточными стенками бактерий. Кислотность красителей обуславливает их более прочное связывание с клеточными стенками бактерий, чем с другими клетками или тканями. Это приводит к селективному окрашиванию только тех клеток, которые обладают высокой плотностью материала клеточной стенки, таких как кислотоустойчивые бактерии. Окраска по Цилю-Нильсену – это двухэтапный процесс. На первом этапе ткань окрашивают основным раствором фуксина, который окрашивает все клетки в розовый цвет. На втором этапе ткань инкубируют в кислотном спиртовом растворе, который обесцвечивает все клетки, кроме кислотоустойчивых, которые сохраняют цвет и выглядят красными. Механизмы, посредством которых образуется этот цвет, недостаточно изучены, но предполагается, что взаимодействие основного фуксина с компонентами клеточной стенки бактерий создает новую молекулу, ответственную за окраску.

Модификации

1% спирта серной кислоты для актиномицетов и нокардий. 0,5–1% спирта серной кислоты для ооцист изоспоры и циклоспоры. 0,25–0,5% спирта серной кислоты для бактериальных эндоспор. При дифференциальном окрашивании используется ледяная уксусная кислота без нагревания, вторичным красителем является метиленовый синий Лоффлера. Также доступна модификация Киниона (или метод холодного окрашивания по Цилю-Нильсену). Существует протокол, в котором моющее средство заменяет высокотоксичный фенол в растворе фуксина.