Введение

Ферменты, расщепляющие нуклеотидную цепь.

В молекулярной биологии эндонуклеазы – это ферменты, которые расщепляют фосфодиэфирную связь внутри полинуклеотидной цепи (а именно ДНК или РНК). Некоторые, такие как дезоксирибонуклеаза I, разрезают ДНК относительно неспецифично (независимо от последовательности), в то время как многие, обычно называемые рестрикционными эндонуклеазами или рестрикционными ферментами, расщепляют только в очень специфических нуклеотидных последовательностях. Эндонуклеазы отличаются от экзонуклеаз, которые расщепляют концы последовательностей распознавания, а не среднюю (эндо) часть. Однако некоторые ферменты, известные как "экзоэндонуклеазы", не ограничиваются какой-либо одной функцией нуклеазы, проявляя свойства как эндо-, так и экзонуклеаз. Имеются данные, свидетельствующие о том, что активность эндонуклеазы проявляется с задержкой по сравнению с активностью экзонуклеазы. Рестрикционные ферменты – это эндонуклеазы из эубактерий и архей, которые распознают определенную последовательность ДНК. Нуклеотидная последовательность, распознаваемая для расщепления рестрикционным ферментом, называется рестрикционным сайтом. Обычно рестрикционный сайт представляет собой палиндромную последовательность длиной около четырех-шести нуклеотидов. Большинство рестрикционных эндонуклеаз расщепляют цепь ДНК неравномерно, оставляя одноцепочечные "липкие концы". Эти концы могут воссоединяться посредством гибридизации и называются "липкими концами". После спаривания фосфодиэфирные связи фрагментов могут быть соединены ДНК-лигазой. Известны сотни рестрикционных эндонуклеаз, каждая из которых атакует различные рестрикционные сайты. Фрагменты ДНК, расщепленные одной и той же эндонуклеазой, могут быть соединены независимо от происхождения ДНК. Такая ДНК называется рекомбинантной ДНК – ДНК, образованная путем соединения генов в новые комбинации. Рестрикционные эндонуклеазы (рестрикционные ферменты) делятся на три категории: тип I, тип II и тип III, в зависимости от их механизма действия. Эти ферменты часто используются в генной инженерии для создания рекомбинантной ДНК для введения в бактериальные, растительные или животные клетки, а также в синтетической биологии. Одной из наиболее известных эндонуклеаз является Cas9.

Категории

В конечном счете, существует три категории рестрикционных эндонуклеаз, которые вносят относительный вклад в расщепление специфических последовательностей. Типы I и III представляют собой крупные мультисубъединичные комплексы, включающие как эндонуклеазную, так и метилазную активность. Тип I может расщеплять в случайных участках на расстоянии около 1000 пар оснований и более от последовательности распознавания и требует АТФ в качестве источника энергии. Тип II ведет себя несколько иначе и был впервые выделен Гамильтоном Смитом в 1970 году. Это более простые эндонуклеазы, не требующие АТФ в процессе деградации. Примеры рестрикционных эндонуклеаз типа II включают BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII и HaeIII. Тип III, однако, расщепляет ДНК примерно на 25 пар оснований от последовательности распознавания и также требует АТФ в этом процессе. Обозначение имеет вид "VwxyZ", где "Vwx" – курсивом – обозначает первую букву рода и первые две буквы вида, в котором может быть обнаружена данная рестрикционная эндонуклеаза, например, Escherichia coli – Eco, и Haemophilus influenzae – Hin. Далее следует необязательный, некурсивный символ "y", указывающий на тип или идентификацию штамма, например, EcoR для штаммов E. coli, несущих фактор переноса резистентности к лекарствам RTF 1, и Hind для штамма H. influenzae d.

Рестрикционные эндонуклеазы бывают нескольких типов. Как правило, рестрикционной эндонуклеазе требуется сайт распознавания и схема расщепления (обычно нуклеотидных оснований: A, C, G, T). Если сайт распознавания находится вне области расщепления, то рестрикционная эндонуклеаза относится к типу I. Если последовательность распознавания перекрывается с последовательностью расщепления, то рестрикционный фермент является эндонуклеазой типа II.

Процессы, связанные с эндонуклеазами

Эндонуклеазы играют роль во многих аспектах биологической жизни. Ниже приведены несколько примеров процессов, в которых эндонуклеазы выполняют ключевую роль.

Ремонт ДНК

Эндонуклеазы играют роль в репарации ДНК. АП-эндонуклеаза, в частности, катализирует вскрытие ДНК исключительно в АП-сайтах, тем самым подготавливая ДНК к последующему удалению, репаративному синтезу и лигированию ДНК. Например, при депурировании это повреждение оставляет дезоксирибозный сахар без основания. АП-эндонуклеаза распознает этот сахар и, по сути, разрезает ДНК в этом месте, после чего репарация ДНК может продолжаться. В клетках *E. coli* содержатся две АП-эндонуклеазы: эндонуклеаза IV (endoIV) и экзонуклеаза III (exoIII), в то время как у эукариот существует только одна АП-эндонуклеаза.

Ремонт кросслинков ДНК

Ремонт ДНК, в котором две комплементарные цепи соединены ковалентной межцепочечной сшивкой, требует множественных надрезов для разъединения цепей и удаления повреждения. Надрезы необходимы с обеих сторон сшивки и на обеих цепях двухцепочечной ДНК. В эмбриональных стволовых клетках мыши промежуточная стадия восстановления сшивок включает образование двухцепочечных разрывов. MUS81/EME1 – это структура-специфичная эндонуклеаза, участвующая в преобразовании межцепочечных сшивок в двухцепочечные разрывы в зависимости от репликации ДНК. Эндонуклеаза V сначала расщепляет гликозильную связь на 5'-стороне пиримидинового димера, а затем катализирует расщепление фосфодиэфирной связи ДНК, которая первоначально соединяла два нуклеотида димера. Последующие этапы процесса восстановления включают удаление остатков димера и репаративный синтез для заполнения образовавшегося одноцепочечного пробела, используя неповрежденную цепь в качестве матрицы.

Апоптоз

Во время апоптоза активируется апоптотическая эндонуклеаза DFF40 для запуска контролируемой дезинтеграции клетки. Эта дезинтеграция характеризуется расщеплением геномной ДНК на специфические фрагменты. Точная роль эндонуклеаз в данном контексте заключается в разрезании ДНК в определенных участках, формируя фрагменты заданной длины. Затем эти фрагменты упаковываются в апоптотические тельца, обеспечивая аккуратное и эффективное удаление умирающей клетки без вызываения воспаления или повреждения соседних клеток.

Репликация ДНК

Эндонуклеаза 1 (FEN1) и эндонуклеаза Dna2 играют ключевую роль в репликации ДНК на отстающей нити, участвуя в важных процессах, таких как удаление праймеров и обработка фрагментов Оказаки. Эндонуклеазы активно участвуют в обработке этих фрагментов, разрезая фосфодиэфирные связи между ними. Этот процесс необходим для непрерывного синтеза и соединения фрагментов Оказаки, обеспечивая целостность вновь синтезированной нити ДНК.

Обработка РНК

Эндонуклеазы, в особенности эндорибонуклеазы, играют ключевую роль в процессинге РНК – фундаментальном этапе экспрессии генов. Этот процесс включает в себя точное расщепление молекул прекурсорной РНК, направляемое эндонуклеазами, для получения функциональных РНК, необходимых для различных клеточных функций. Эндонуклеазы избирательно расщепляют прекурсорные РНК в специфических участках, определяя границы функциональных сегментов РНК в ходе процессинга РНК. Результатом процессинга РНК является образование функциональных молекул РНК, таких как транспортные РНК (тРНК) и рибосомные РНК (рРНК). Эндонуклеазы обеспечивают точность этого процесса, гарантируя формирование зрелых и функциональных молекул РНК. Эндонуклеазы, такие как RNase P и tRNase Z (ELAC2), преобразуют прекурсоры тРНК в зрелые, функциональные тРНК, критически важные для точного трансляции во время синтеза белка. В биогенезе рибосом эндонуклеазы семейства RNase III, такие как DROSHA, участвуют в процессинге прекурсорных рРНК, способствуя сборке функциональных рибосом. DICER и DROSHA, также относящиеся к семейству RNase III, участвуют в процессинге пре-миРНК в функциональную миРНК.

Созревание ногтей и волос

Эндонуклеаза DNase1L2 также существенно участвует в удалении ДНК при формировании волос и ногтей. Этот процесс необходим для созревания структур волос и ногтей и играет решающую роль в преобразовании клеток в прочные, кератинизированные образования, обеспечивающие прочность и целостность волос и ногтей.

Мутации

Ксеродермия пигментоза – редкое аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное дефектом УФ-специфической эндонуклеазы. Пациенты с мутациями не способны восстанавливать повреждения ДНК, вызванные солнечным светом. Серповидноклеточная анемия – заболевание, вызванное точечной мутацией. Последовательность, измененная мутацией, устраняет сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы MstII, которая распознает определенную нуклеотидную последовательность. Мутации эндонуклеазы сплайсинга тРНК вызывают понтоцеребеллярную гипоплазию. Понтоцеребеллярные гипоплазии (ПЦГ) представляют собой группу нейродегенеративных аутосомно-рецессивных заболеваний, вызванных мутациями в трех из четырех различных субъединиц комплекса эндонуклеазы сплайсинга тРНК.