Рестрикционные эндонуклеазы: ферменты, разрезающие ДНК

Введение

Класс ферментов, расщепляющих ДНК

Рестрикционный фермент, рестрикционная эндонуклеаза, REase, ENase или рестриктаза – это фермент, который разрезает ДНК на фрагменты в специфических участках распознавания или вблизи них, известных как рестрикционные сайты. Рестрикционные ферменты являются одним классом более широкой группы эндонуклеаз. Рестрикционные ферменты обычно классифицируются на пять типов, различающихся по своей структуре и тому, разрезают ли они ДНК-субстрат непосредственно в участке распознавания, или участки распознавания и разрезания разделены. Для разрезания ДНК все рестрикционные ферменты делают два надреза, каждый раз через цепь сахарофосфатного остова (то есть каждую нить) двойной спирали ДНК. Эти ферменты встречаются у бактерий и архей и обеспечивают защитный механизм против вторжения вирусов. Внутри прокариот рестрикционные ферменты избирательно разрезают чужеродную ДНК в процессе, называемом рестрикционным перевариванием, в то время как ДНК хозяина защищена ферментом модификации (метилтрансферазой), который модифицирует прокариотическую ДНК и предотвращает расщепление. Вместе эти два процесса образуют систему рестрикции-модификации. Известно более 3600 рестрикционных эндонуклеаз, представляющих более 250 различных специфичностей. Более 3000 из них были детально изучены, и более 800 доступны в продаже. Эти ферменты регулярно используются для модификации ДНК в лабораториях и являются важным инструментом в молекулярном клонировании.

История

Термин «фермент рестрикции» возник в ходе изучения фага λ, вируса, инфицирующего бактерии, и явления контролируемого хозяином ограничения и модификации этого бактериального фага или бактериофага. Это явление было впервые выявлено в работах, проведенных в лабораториях Сальвадора Лурии, Жана Вейгля и Джузеппе Бертани в начале 1950-х годов. Было обнаружено, что для бактериофага λ, способного хорошо расти в одном штамме Escherichia coli, например, E. coli C, при культивировании в другом штамме, например, E. coli K, его выход может значительно снижаться, вплоть до 3-5 порядков величины. Клетка-хозяин, в данном случае E. coli K, известна как ограничивающий хозяин и, по-видимому, обладает способностью снижать биологическую активность фага λ. Если фаг закрепился в одном штамме, способность этого фага к росту также ограничивается в других штаммах. В 1960-х годах в лабораториях Вернера Арбера и Мэтью Меселсона было показано, что ограничение вызвано ферментативным расщеплением ДНК фага, и, следовательно, участвующий в этом фермент был назван ферментом рестрикции. Рестрикционные ферменты, изученные Арбером и Меселсоном, были ферментами рестрикции I типа, которые расщепляют ДНК случайным образом вдали от сайта распознавания. В 1970 году Гамильтон О. Смит, Томас Келли и Кент Уилкокс выделили и охарактеризовали первый фермент рестрикции II типа, HindII, из бактерии Haemophilus influenzae. Ферменты рестрикции этого типа более полезны для лабораторных работ, поскольку они расщепляют ДНК в месте их последовательности распознавания и наиболее часто используются в качестве инструмента молекулярной биологии. Позже Дэниел Натанс и Кэтлин Данна показали, что расщепление ДНК вируса обезьяны 40 (SV40) ферментами рестрикции дает специфические фрагменты, которые можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, тем самым продемонстрировав, что ферменты рестрикции также могут использоваться для картирования ДНК. За работы по открытию и характеристике ферментов рестрикции Нобелевская премия по физиологии или медицине 1978 года была присуждена Вернеру Арберу, Дэниелу Натансу и Гамильтону О. Смиту. Открытие ферментов рестрикции позволило манипулировать ДНК, что привело к развитию технологии рекомбинантной ДНК, имеющей множество применений, например, обеспечивающей крупномасштабное производство белков, таких как человеческий инсулин, используемый пациентами с диабетом.

The term restriction enzyme originated from the studies of phage λ, a virus that infects bacteria, and the phenomenon of host controlled restriction and modification of such bacterial phage or bacteriophage. The phenomenon was first identified in work done in the laboratories of Salvador Luria, Jean Weigle and Giuseppe Bertani in the early 1950s. It was found that, for a bacteriophage λ that can grow well in one strain of Escherichia coli, for example E. coli C, when grown in another strain, for example E. coli K, its yields can drop significantly, by as much as 3 5 orders of magnitude. The host cell, in this example E. coli K, is known as the restricting host and appears to have the ability to reduce the biological activity of the phage λ. If a phage becomes established in one strain, the ability of that phage to grow also becomes restricted in other strains. In the 1960s, it was shown in work done in the laboratories of Werner Arber and Matthew Meselson that the restriction is caused by an enzymatic cleavage of the phage DNA, and the enzyme involved was therefore termed a restriction enzyme. The restriction enzymes studied by Arber and Meselson were type I restriction enzymes, which cleave DNA randomly away from the recognition site. In 1970, Hamilton O. Smith, Thomas Kelly and Kent Wilcox isolated and characterized the first type II restriction enzyme, HindII, from the bacterium Haemophilus influenzae. Restriction enzymes of this type are more useful for laboratory work as they cleave DNA at the site of their recognition sequence and are the most commonly used as a molecular biology tool. Later, Daniel Nathans and Kathleen Danna showed that cleavage of simian virus 40 (SV40) DNA by restriction enzymes yields specific fragments that can be separated using polyacrylamide gel electrophoresis, thus showing that restriction enzymes can also be used for mapping DNA. For their work in the discovery and characterization of restriction enzymes, the 1978 Nobel Prize for Physiology or Medicine was awarded to Werner Arber, Daniel Nathans, and Hamilton O. Smith. The discovery of restriction enzymes allows DNA to be manipulated, leading to the development of recombinant DNA technology that has many applications, for example, allowing the large scale production of proteins such as human insulin used by diabetic patients.

Происхождение

Энзимы рестрикции, вероятно, произошли от общего предка и получили широкое распространение посредством горизонтального переноса генов. Кроме того, накапливаются данные, свидетельствующие о том, что рестрикционные эндонуклеазы эволюционировали как эгоистичный генетический элемент.

Тип I

Рестрикционные ферменты типа I были первыми идентифицированными и впервые обнаружены в двух различных штаммах (K 12 и B) *E. coli*. Эти ферменты разрезают ДНК в точке, отличной от сайта распознавания, на случайном расстоянии (не менее 1000 п.н.) от него. Расщепление в этих случайных точках происходит посредством транслокации ДНК, что указывает на то, что эти ферменты также являются молекулярными моторами. Сайт распознавания асимметричен и состоит из двух специфических участков – один содержит 3–4 нуклеотида, а другой – 4–5 нуклеотидов, разделенных неспецифическим спейсером длиной около 6–8 нуклеотидов. Эти ферменты многофункциональны и способны как к рестрикционному перевариванию, так и к модификации, в зависимости от статуса метилирования целевой ДНК. Для их полной активности необходимы кофакторы S-аденозилметионин (AdoMet), гидролизованный аденозинтрифосфат (ATP) и ионы магния (Mg2+). Рестрикционные ферменты типа I состоят из трех субъединиц: HsdR, HsdM и HsdS. HsdR необходим для рестрикционного переваривания; HsdM – для добавления метильных групп к ДНК хозяина (метилтрансферазная активность), а HsdS – для специфичности сайта распознавания (связывания ДНК), а также для рестрикционного переваривания (расщепления ДНК) и модификации (метилтрансферазной активности ДНК). Два каталитических иона магния (по одному от каждого мономера) изображены в виде пурпурных сфер и расположены рядом с разрезанными участками ДНК, образованными ферментом (изображены как разрывы в цепи ДНК). Типичные рестрикционные ферменты типа II отличаются от ферментов типа I несколькими характеристиками. Они формируют гомодимеры с сайтами распознавания, которые обычно не разделены, палиндромны и имеют длину 4–8 нуклеотидов. Они распознают и разрезают ДНК в одном и том же месте и не используют ATP или AdoMet для своей активности – обычно им требуется только Mg2+ в качестве кофактора. Это наиболее распространенные и используемые рестрикционные ферменты. В 1990-х и начале 2000-х годов были обнаружены новые ферменты из этого семейства, которые не соответствовали всем классическим критериям этого класса ферментов, и была разработана новая номенклатура подсемейств для разделения этого большого семейства на подкатегории на основе отклонений от типичных характеристик ферментов типа II. Рестрикционные эндонуклеазы типа IIS (например, FokI) разрезают ДНК на определенном расстоянии от их непалиндромных асимметричных сайтов распознавания. Эти ферменты содержат более одной субъединицы и требуют кофакторов AdoMet и ATP для их роли в метилировании ДНК и рестрикционном переваривании соответственно. Они являются компонентами прокариотических механизмов рестрикции-модификации ДНК, которые защищают организм от вторжения чужеродной ДНК. Ферменты типа III – это гетероолигомерные, многофункциональные белки, состоящие из двух субъединиц: Res и Mod. Субъединица Mod распознает последовательность ДНК, специфичную для системы, и является модифицирующей метилтрансферазой; таким образом, она функционально эквивалентна субъединицам M и S эндонуклеазы рестрикции типа I. Res необходим для рестрикционного переваривания, хотя сам по себе не обладает ферментативной активностью. Ферменты типа III распознают короткие асимметричные последовательности ДНК длиной 5–6 п.н. и разрезают ДНК на расстоянии 25–27 п.н. от сайта распознавания, оставляя короткие одноцепочечные 5'-концы. Для их активности требуется наличие двух инвертированно ориентированных неметилированных сайтов распознавания. Эти ферменты метилируют только одну цепь ДНК в положении N6 адениновых остатков, поэтому вновь реплицированная ДНК будет иметь только одну метилированную цепь, чего достаточно для защиты от рестрикционного переваривания. Ферменты типа III относятся к бета-подсемейству N6-аденинметилтрансфераз, содержащих девять мотивов, характеризующих это семейство, включая мотив I – сайт связывания AdoMet (FXGXG) и мотив IV – каталитический центр (S/D/N(PP)Y/F).

Type I restriction enzymes were the first to be identified and were first identified in two different strains (K 12 and B) of E. coli. These enzymes cut at a site that differs, and is a random distance (at least 1000 bp) away, from their recognition site. Cleavage at these random sites follows a process of DNA translocation, which shows that these enzymes are also molecular motors. The recognition site is asymmetrical and is composed of two specific portions—one containing 3–4 nucleotides, and another containing 4–5 nucleotides—separated by a non specific spacer of about 6–8 nucleotides. These enzymes are multifunctional and are capable of both restriction digestion and modification activities, depending upon the methylation status of the target DNA. The cofactors S Adenosyl methionine (AdoMet), hydrolyzed adenosine triphosphate (ATP), and magnesium (Mg2+) ions, are required for their full activity. Type I restriction enzymes possess three subunits called HsdR, HsdM, and HsdS; HsdR is required for restriction digestion; HsdM is necessary for adding methyl groups to host DNA (methyltransferase activity), and HsdS is important for specificity of the recognition (DNA binding) site in addition to both restriction digestion (DNA cleavage) and modification (DNA methyltransferase) activity. Two catalytic magnesium ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone). Typical type II restriction enzymes differ from type I restriction enzymes in several ways. They form homodimers, with recognition sites that are usually undivided and palindromic and 4–8 nucleotides in length. They recognize and cleave DNA at the same site, and they do not use ATP or AdoMet for their activity—they usually require only Mg2+ as a cofactor. These are the most commonly available and used restriction enzymes. In the 1990s and early 2000s, new enzymes from this family were discovered that did not follow all the classical criteria of this enzyme class, and new subfamily nomenclature was developed to divide this large family into subcategories based on deviations from typical characteristics of type II enzymes. Type IIS restriction endonucleases (e. g. FokI) cleave DNA at a defined distance from their non palindromic asymmetric recognition sites; These enzymes contain more than one subunit and require AdoMet and ATP cofactors for their roles in DNA methylation and restriction digestion, respectively. They are components of prokaryotic DNA restriction modification mechanisms that protect the organism against invading foreign DNA. Type III enzymes are hetero oligomeric, multifunctional proteins composed of two subunits, Res and Mod The Mod subunit recognises the DNA sequence specific for the system and is a modification methyltransferase; as such, it is functionally equivalent to the M and S subunits of type I restriction endonuclease. Res is required for restriction digestion, although it has no enzymatic activity on its own. Type III enzymes recognise short 5–6 bp long asymmetric DNA sequences and cleave 25–27 bp downstream to leave short, single stranded 5' protrusions. They require the presence of two inversely oriented unmethylated recognition sites for restriction digestion to occur. These enzymes methylate only one strand of the DNA, at the N 6 position of adenine residues, so newly replicated DNA will have only one strand methylated, which is sufficient to protect against restriction digestion. Type III enzymes belong to the beta subfamily of N6 adenine methyltransferases, containing the nine motifs that characterise this family, including motif I, the AdoMet binding pocket (FXGXG), and motif IV, the catalytic region (S/D/N (PP) Y/F).

Тип IV

Ферменты типа IV распознают модифицированную, как правило, метилированную ДНК, и примерами таких систем служат McrBC и Mrr у *E. coli*.

Тип V

Рестрикционные ферменты типа V (например, комплекс Cas9 gRNA из CRISPR).

Энзимы искусственного ограничения

Искусственные ферменты рестрикции могут быть получены путем слияния естественного или сконструированного ДНК-связывающего домена с нуклеазным доменом (часто доменом расщепления рестрикции типа IIS FokI). Такие искусственные ферменты ограничения могут нацеливаться на большие участки ДНК (до 36 пар оснований) и могут быть сконструированы для связывания с желаемыми последовательностями ДНК. Нуклеазы цинковых пальцев являются наиболее часто используемыми искусственными ферментами ограничения и обычно применяются в генной инженерии, но также могут использоваться и для стандартных задач клонирования генов. Другие искусственные ферменты рестрикции основаны на ДНК-связывающем домене эффекторов TAL. В 2013 году была разработана новая технология CRISPR-Cas9, основанная на прокариотической системе вирусной защиты, для редактирования генома, и она быстро нашла применение в лабораториях. Подробнее см. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). В 2017 году группа из Университета Иллинойса сообщила об использовании белка аргонавта, выделенного из Pyrococcus furiosus (PfAgo), вместе с направляющей ДНК для редактирования ДНК in vitro в качестве искусственных ферментов рестрикции. Также были разработаны искусственные рибонуклеазы, действующие как ферменты рестрикции для РНК. Система на основе PNA, называемая PNAzyme, содержит группу Cu(II) 2,9-диметилфенантролина, которая имитирует рибонуклеазы для специфической последовательности РНК и расщепляет небазоспаренную область (выпуклость РНК) целевой РНК, формирующуюся при связывании фермента с РНК. Этот фермент проявляет селективность, расщепляя только в одном месте, которое либо не содержит неспаренных оснований, либо является кинетически предпочтительным из двух возможных мест расщепления.

Приложения

Изолированные ферменты рестрикции используются для манипулирования ДНК в различных научных приложениях. Они применяются для облегчения вставки генов в плазмидные векторы при клонировании генов и проведении экспериментов по производству белков. Для оптимального использования плазмиды, обычно используемые для клонирования генов, модифицируются для включения короткой полилинкерной последовательности (называемой множественным местом клонирования, или MCS), богатой последовательностями распознавания ферментов рестрикции. Это обеспечивает гибкость при вставке фрагментов генов в плазмидный вектор; участки рестрикции, естественно присутствующие в генах, влияют на выбор эндонуклеазы для переваривания ДНК, поскольку необходимо избегать рестрикции целевой ДНК при намеренном разрезании концов ДНК. Для клонирования фрагмента гена в вектор, как плазмидная ДНК, так и генный фрагмент обычно разрезаются одними и теми же ферментами рестрикции, а затем соединяются вместе с помощью фермента, известного как ДНК-лигаза. Ферменты рестрикции также могут использоваться для различения аллелей генов путем специфического распознавания однонуклеотидных изменений в ДНК, известных как однонуклеотидные полиморфизмы (СНП). Однако это возможно только в том случае, если СНП изменяет участок рестрикции, присутствующий в аллеле. В этом методе фермент рестрикции может быть использован для генотипирования образца ДНК без необходимости дорогостоящего секвенирования генов. Образец сначала переваривается ферментом рестрикции для получения фрагментов ДНК, а затем фрагменты разных размеров разделяются с помощью гелевого электрофореза. Как правило, аллели с корректными участками рестрикции генерируют две видимые полосы ДНК на геле, а аллели с измененными участками рестрикции не разрезаются и генерируют только одну полосу. Также можно создать карту ДНК путем рестрикционного переваривания, которая позволяет определить относительное положение генов. Различные длины ДНК, полученные в результате рестрикционного переваривания, также создают специфический рисунок полос после гелевого электрофореза и могут использоваться для ДНК-дактилоскопии. Аналогичным образом, ферменты рестрикции используются для переваривания геномной ДНК при анализе генов методом Саузерн-блоттинга. Эта техника позволяет исследователям определить количество копий (или паралогов) гена, присутствующих в геноме одного индивида, или количество мутаций (полиморфизмов) генов, произошедших в популяции. Последний пример называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (RFLP). Искусственные ферменты рестрикции, созданные путем связывания домена расщепления ДНК FokI с массивом белков, связывающих ДНК, или массивами цинковых пальцев, обозначаемых нуклеазами цинковых пальцев (ZFN), являются мощным инструментом для редактирования генома хозяина благодаря их повышенной специфичности последовательности. ZFN работают в парах, их димеризация опосредована in situ через домен FokI. Каждый массив цинковых пальцев (ZFA) способен распознавать 9–12 пар оснований, что составляет 18–24 для пары. Пространство в 5–7 пар оснований между участками расщепления дополнительно повышает специфичность ZFN, делая их безопасным и более точным инструментом, который может применяться у людей. Недавно было проведено клиническое исследование фазы I ZFN для целенаправленного уничтожения корецептора CCR5 для ВИЧ-1. Другие предложили использовать бактериальную систему R-M в качестве модели для разработки антивирусных генов человека или геномных вакцин и терапий, поскольку система R-M выполняет роль врожденной защиты у бактерий, ограничивая тропизм бактериофагами. Существуют исследования REases и ZFN, которые могут расщеплять ДНК различных человеческих вирусов, включая HSV-2, высокорискованные ВПЧ и ВИЧ-1, с конечной целью индуцирования мутагенеза мишени и аберраций вирусов, инфицирующих человека. В геноме человека уже содержатся остатки ретровирусных геномов, которые были инактивированы и использованы в собственных целях. Действительно, механизмы подавления активных L1 геномных ретроэлементов тремя основным репарационным экзонуклеазой 1 (TREX1) и репарационным кросс-комплементированием 1 (ERCC) по-видимому имитируют действие систем R-M у бактерий, а также нехомологичное соединение концов (NHEJ), которое следует за использованием ZFN без шаблона репарации.

Isolated restriction enzymes are used to manipulate DNA for different scientific applications. They are used to assist insertion of genes into plasmid vectors during gene cloning and protein production experiments. For optimal use, plasmids that are commonly used for gene cloning are modified to include a short polylinker sequence (called the multiple cloning site, or MCS) rich in restriction enzyme recognition sequences. This allows flexibility when inserting gene fragments into the plasmid vector; restriction sites contained naturally within genes influence the choice of endonuclease for digesting the DNA, since it is necessary to avoid restriction of wanted DNA while intentionally cutting the ends of the DNA. To clone a gene fragment into a vector, both plasmid DNA and gene insert are typically cut with the same restriction enzymes, and then glued together with the assistance of an enzyme known as a DNA ligase. Restriction enzymes can also be used to distinguish gene alleles by specifically recognizing single base changes in DNA known as single nucleotide polymorphisms (SNPs). This is however only possible if a SNP alters the restriction site present in the allele. In this method, the restriction enzyme can be used to genotype a DNA sample without the need for expensive gene sequencing. The sample is first digested with the restriction enzyme to generate DNA fragments, and then the different sized fragments separated by gel electrophoresis. In general, alleles with correct restriction sites will generate two visible bands of DNA on the gel, and those with altered restriction sites will not be cut and will generate only a single band. A DNA map by restriction digest can also be generated that can give the relative positions of the genes. The different lengths of DNA generated by restriction digest also produce a specific pattern of bands after gel electrophoresis, and can be used for DNA fingerprinting. In a similar manner, restriction enzymes are used to digest genomic DNA for gene analysis by Southern blot. This technique allows researchers to identify how many copies (or paralogues) of a gene are present in the genome of one individual, or how many gene mutations (polymorphisms) have occurred within a population. The latter example is called restriction fragment length polymorphism (RFLP). Artificial restriction enzymes created by linking the FokI DNA cleavage domain with an array of DNA binding proteins or zinc finger arrays, denoted zinc finger nucleases (ZFN), are a powerful tool for host genome editing due to their enhanced sequence specificity. ZFN work in pairs, their dimerization being mediated in situ through the FokI domain. Each zinc finger array (ZFA) is capable of recognizing 9–12 base pairs, making for 18–24 for the pair. A 5–7 bp spacer between the cleavage sites further enhances the specificity of ZFN, making them a safe and more precise tool that can be applied in humans. A recent Phase I clinical trial of ZFN for the targeted abolition of the CCR5 co receptor for HIV 1 has been undertaken. Others have proposed using the bacteria R M system as a model for devising human anti viral gene or genomic vaccines and therapies since the RM system serves an innate defense role in bacteria by restricting tropism by bacteriophages. There is research on REases and ZFN that can cleave the DNA of various human viruses, including HSV 2, high risk HPVs and HIV 1, with the ultimate goal of inducing target mutagenesis and aberrations of human infecting viruses. The human genome already contains remnants of retroviral genomes that have been inactivated and harnessed for self gain. Indeed, the mechanisms for silencing active L1 genomic retroelements by the three prime repair exonuclease 1 (TREX1) and excision repair cross complementing 1(ERCC) appear to mimic the action of RM systems in bacteria, and the non homologous end joining (NHEJ) that follows the use of ZFN without a repair template.