Введение

Класс ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты

В биохимии нуклеаза (также устаревшие названия – нуклеодеполимераза или полинуклеотидаза) – это фермент, способный расщеплять фосфодиэфирные связи между нуклеотидами нуклеиновых кислот. Нуклеазы вызывают разрывы как в одноцепочечных, так и в двуцепочечных молекулах-мишенях. В живых организмах они являются ключевым механизмом для многих аспектов репарации ДНК. Дефекты в определенных нуклеазах могут приводить к генетической нестабильности или иммунодефициту. Нуклеазы также широко используются в молекулярном клонировании. Существует две основные классификации, основанные на месте действия. Экзонуклеазы расщепляют нуклеиновые кислоты от концов. Эндонуклеазы действуют на участки в середине молекулы-мишени. Они далее подразделяются на дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. Первые действуют на ДНК, вторые – на РНК. Один из этих ферментов добавляет метильную группу к ДНК, образуя метилированную ДНК, в то время как другой расщепляет неметилированную ДНК в различных местах вдоль молекулы. Первый тип фермента был назван "метилазой", а второй – "рестрикционной нуклеазой". Эти ферментативные инструменты были важны для ученых, разрабатывавших методы "вырезания и вставки" молекул ДНК. Тогда требовался инструмент, который разрезал бы ДНК в специфических местах, а не случайным образом по всей длине молекулы, чтобы ученые могли разрезать молекулы ДНК предсказуемым и воспроизводимым образом. Важным достижением стало то, что Х.О. Смит, К.У. Уилкокс и Т.Дж. Келли, работавшие в Университете Джона Хопкинса в 1968 году, изолировали и охарактеризовали первую рестрикционную нуклеазу, функционирование которой зависело от определенной последовательности нуклеотидов ДНК. Работая с бактериями *Haemophilus influenzae*, эта группа выделила фермент, названный HindII, который всегда разрезал молекулы ДНК в определенной точке внутри специфической последовательности из шести пар оснований. Они обнаружили, что фермент HindII всегда разрезает точно в центре этой последовательности (между 3-й и 4-й парой оснований).

Система цифровой классификации

Большинство нуклеаз классифицируются Комиссией по ферментам "Комитета по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии" как гидролазы (EC номер 3). Нуклеазы, подобно фосфодиэстеразам, липазам и фосфатазам, относятся к эстеразам (EC номер 3.1) – подгруппе гидролаз. Эстеразы, к которым принадлежат нуклеазы, классифицируются под EC номерами 3.1.11 и 3.1.31.

Структура

Первичная структура нуклеаз в большинстве случаев слабо консервативна и минимально консервативна в активных центрах, поверхности которых преимущественно состоят из кислых и основных аминокислотных остатков. Нуклеазы можно классифицировать по семействам структурной организации.

Опознание места

Нуклеаза должна ассоциироваться с нуклеиновой кислотой, прежде чем она сможет расщепить молекулу. Это подразумевает определенный уровень распознавания. Нуклеазы используют как неспецифические, так и специфические взаимодействия в своих механизмах распознавания и связывания. Оба механизма играют важную роль в живых организмах, особенно в репарации ДНК. Неспецифические эндонуклеазы, участвующие в репарации ДНК, могут сканировать ДНК в поисках целевых последовательностей или повреждений. Такая нуклеаза диффундирует вдоль ДНК, пока не встретит цель, после чего остатки ее активного центра взаимодействуют с химическими группами ДНК. В случае эндонуклеаз, таких как EcoRV, BamHI и PvuII, это неспецифическое связывание включает электростатические взаимодействия между небольшой площадью поверхности белка и ДНК. Эта слабая ассоциация не деформирует общую структуру ДНК, сохраняя ее в B-форме.

Остановился форк репликации

Многие формы повреждений ДНК останавливают продвижение репликационной вилки, заставляя ДНК-полимеразы и связанный с ними аппарат покидать вилку. Затем вилка должна быть обработана белками, специфичными для репликационных вилок. Наиболее важным из них является MUS81. Делеции гена MUS81 вызывают чувствительность дрожжей к УФ-излучению или метилирующим повреждениям, а также дефекты мейоза.

Ремонт несоответствия

Ремонт неспаривания ДНК в любом организме осуществляется набором эндонуклеаз, специфичных к неспариваниям. У прокариот эту роль в основном выполняют MutSLH и белки, связанные с репарацией очень коротких участков (VSP-репарация). Система MutSLH (состоящая из MutS, MutL и MutH) исправляет точечные мутации и небольшие инсерции/делеции. MutS распознает и связывается с неспариваниями, после чего рекрутирует MutL и MutH. MutL опосредует взаимодействие между MutS и MutH и усиливает эндонуклеазную активность последнего. MutH распознает гемиметилированные участки 5'-GATC-3' и осуществляет разрез рядом с G неметилированной цепи (более недавно синтезированной цепи). VSP-репарация инициируется эндонуклеазой Vsr. Она исправляет специфическое несовпадение T/G, вызванное спонтанным деаминированием метилированных цитозинов в тимины. Vsr распознает последовательность 5'-CTWGG-3', где она осуществляет надрез в цепи ДНК на 5'-стороне от неспаренного тимина (подчеркнуто в предыдущей последовательности). Затем одна из экзонуклеаз – RecJ, ExoVII или ExoI – деградирует участок, после чего ДНК-полимераза ресинтезирует разрыв в цепи. V(D)J-рекомбинация включает в себя раскрытие шпильковых структур, связанных с двунитевыми разрывами, и последующее соединение обоих концов. Комплекс Artemis/DNA-PKcs участвует в этой реакции. Хотя Artemis проявляет 5'→3'-экзонуклеазную активность в одиночку, ее комплексообразование с DNA-PKcs позволяет осуществлять эндонуклеазную обработку шпильковых структур. Дефекты любого из этих белков приводят к тяжелому иммунодефициту. Гомологичная рекомбинация, с другой стороны, включает в себя два гомологичных дуплекса ДНК, соединенных D-петлями или соединениями Холлидея. У бактерий эндонуклеазы, такие как RuvC, разрешают соединения Холлидея на две отдельные двунитевые ДНК, осуществляя разрез в двух симметричных точках вблизи центра соединения. У эукариот FEN1, XPF-ERCC1 и MUS81 расщепляют D-петли, а Cce1/Ydc2 обрабатывают соединения Холлидея в митохондриях.

Меганкулезы

Частота, с которой конкретная нуклеаза разрезает данную молекулу ДНК, зависит от сложности ДНК и длины последовательности распознавания нуклеазы. Из-за статистической вероятности случайного появления определенной последовательности оснований, более длинная последовательность распознавания приводит к менее частому расщеплению. Например, можно предположить, что последовательность из четырех оснований (соответствующая сайту распознавания гипотетической нуклеазы) будет встречаться в среднем каждые 256 пар оснований (поскольку 4⁴ = 256), а последовательность из шести оснований – в среднем раз в 4096 пар оснований (4⁶ = 4096). Уникальным семейством нуклеаз являются мегануклеазы, которые характеризуются более длинными и, следовательно, менее распространенными последовательностями распознавания, состоящими из 12–40 пар оснований. Эти нуклеазы особенно полезны в генетической и геномной инженерии сложных организмов, таких как растения и млекопитающие, где большие геномы (содержащие миллиарды пар оснований) могут приводить к частому и нежелательному специфическому расщеплению при использовании традиционных нуклеаз.