Антисмысловые РНК: регуляция экспрессии генов и эпигенетические механизмы.
Antisense RNA
антисмысловые РНК (asRNA): роль в регуляции экспрессии генов, блокировка трансляции мРНК. Обнаружены у прокариот и эукариот. Новые методы исследования.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Антисмысловая РНК (asRNA), также называемая антисмысловой транскрипцией, естественной антисмысловой транскрипцией (NAT) или антисмысловым олигонуклеотидом, представляет собой одноцепочечную РНК, комплементарную кодирующей белок матричной РНК (мРНК), с которой она гибридизуется, тем самым блокируя её трансляцию в белок. Антисмысловые РНК (возникающие естественным образом) были обнаружены как у прокариот, так и у эукариот. Хотя многие результаты, полученные с помощью вышеупомянутых методов, привели к большому количеству потенциальных антисмысловых РНК, лишь немногие были подтверждены как настоящие антисмысловые РНК посредством дальнейших функциональных исследований. Для минимизации числа ложноположительных результатов, новые подходы последних лет сосредоточены на транскрипции, специфичной для цепи, некодирующих РНК, связывающихся с хроматином, и исследованиях отдельных клеток.
Antisense RNA (asRNA), also referred to as antisense transcript, natural antisense transcript (NAT) or antisense oligonucleotide, is a single stranded RNA that is complementary to a protein coding messenger RNA (mRNA) with which it hybridizes, and thereby blocks its translation into protein. The asRNAs (which occur naturally) have been found in both prokaryotes and eukaryotes, Although many findings from the approaches mentioned above gave rise to a lot of possible asRNAs, only few were proven to be actual asRNAs via further functional tests. To minimize the number of false positive results, new approaches from recent years have been focusing on strand specific transcription, chromatin binding noncoding RNAs and single cell studies.
Примеры для разных видов
Первоначально обнаруженные asRNA были в прокариотах, включая плазмиды, бактериофаги и бактерии. Например, в плазмиде ColE1 asRNA, называемая RNA I, играет важную роль в определении количества копий плазмиды путем контроля репликации. Репликация ColE1 основана на транскрипции праймерной RNA, называемой RNA II. После транскрибирования RNA II гибридизируется со своей ДНК-матрицей и впоследствии расщепляется RNase H. В присутствии asRNA RNA I, RNA I и RNA II образуют дуплекс, который вызывает конформационное изменение RNA II. Следовательно, RNA II не может гибридизироваться со своей ДНК-матрицей, что приводит к низкому количеству копий ColE1. В бактериофаге P22 asRNA sar помогает регулировать литический и лизогенный циклы, контролируя экспрессию Ant. Помимо экспрессии в прокариотах, asRNA также были обнаружены в растениях. Наиболее хорошо описанный пример регуляции asRNA у растений – это ген Flowering Locus C (FLC). Ген FLC в Arabidopsis thaliana кодирует транскрипционный фактор, который предотвращает экспрессию ряда генов, индуцирующих переход к цветению. В холодной среде asRNA гена FLC, обозначаемая COOLAIR, экспрессируется и ингибирует экспрессию FLC посредством модификации хроматина, что, в свою очередь, позволяет начаться цветению. Другим хорошо изученным примером является ген DOG1 (Delay of Germination 1). Его уровень экспрессии отрицательно регулируется антисмысловым транскриптом (asDOG1 или 1GOD), действующим в цис. В клетках млекопитающих типичным примером регуляции asRNA является инактивация X-хромосомы. Xist, asRNA, может рекрутировать поликомбный репрессивный комплекс 2 (PRC2), что приводит к гетерохроматинизации X-хромосомы. В контексте эпигенетической модификации, цис-действие относится к природе этих asRNA, которые регулируют эпигенетические изменения вблизи локусов, где они транскрибируются. Вместо нацеливания на отдельные мРНК, эти цис-действующие эпигенетические регуляторы могут рекрутировать ферменты, модифицирующие хроматин, которые могут оказывать влияние как на локусы транскрипции, так и на соседние гены. Экспрессия гена гемоглобина альфа1 (HBA1) подавляется аномальным транскриптом предполагаемого белка, связывающего РНК Luc7-like (LUC71), который служит asRNA для HBA1 и индуцирует метилирование промотора HBA1. Имеются данные, что метилирование гистонов может быть индуцировано asRNA. Например, ANRIL, помимо способности индуцировать метилирование ДНК, также может подавлять соседние гены CDKN2B и CDKN2A, рекрутируя поликомбный репрессивный комплекс 2 (PRC2), что приводит к метилированию гистонов (H3K27me). Другим классическим примером является инактивация X-хромосомы посредством XIST. Во-первых, asRNA и antagoNATs могут быть легко деградированы RNase или другими деградирующими ферментами. Для предотвращения деградации терапевтических олигонуклеотидов обычно требуется химическая модификация. Наиболее распространенной химической модификацией олигонуклеотидов является добавление фосфоротиоатной связи к основной цепи. Однако фосфоротиоатная модификация может быть провоспалительной. Нежелательные эффекты, включая лихорадку, озноб или тошноту, наблюдались после местной инъекции олигонуклеотидов, модифицированных фосфоротиоатами. Во-вторых, токсичность, не связанная с целевым действием, также представляет собой серьезную проблему. Несмотря на специфичность эндогенных asRNA к определенному локусу, только 10–50% синтезированных олигонуклеотидов демонстрировали ожидаемый эффект нацеливания. Одной из возможных причин этой проблемы является высокая требовательность к структуре asRNA для распознавания целевой последовательностью и RNase H. Одно несовпадение может привести к искажению вторичной структуры и вызвать побочные эффекты. Наконец, было показано, что искусственные asRNA имеют ограниченное внутриклеточное поглощение. Хотя было показано, что нейроны и глия способны свободно поглощать олигонуклеотиды без смысла, переносчики, такие как вирусы и липидные везикулы, все же будут идеальными для контроля и мониторинга внутриклеточной концентрации и метаболизма.
The initial asRNAs discovered were in prokaryotes including plasmids, bacteriophage and bacteria. For example, in plasmid ColE1, the asRNA termed RNA I plays an important role in determining the plasmid copy number by controlling replication. The replication of ColE1 relies on the transcription of a primer RNA named RNA II. Once RNA II is transcribed, it hybridizes to its DNA template and later cleaved by RNase H. In the presence of the asRNA RNA I, RNA I and RNA II forms a duplex which introduces a conformational change of RNA II. Consequently, RNA II cannot hybridize with its DNA template which results in a low copy number of ColE1. In bacteriophage P22, the asRNA sar helps regulate between lytic and lysogenic cycle by control the expression of Ant. Besides being expressed in prokaryotes, asRNAs were also discovered in plants. The most well described example of asRNA regulation in plants is on Flowering Locus C (FLC) gene. FLC gene in Arabidopsis thaliana encodes for a transcription factor that prevent expression of a range of genes that induce floral transition. In cold environment, the asRNA of FLC gene, denoted COOLAIR, is expressed and inhibits the expression of FLC via chromatin modification which consequently allows for flowering. Another well studied example is DOG1 (Delay of Germination 1) gene. Its expression level is negatively regulated by the antisense transcript (asDOG1 or 1GOD) acting in cis. In mammalian cells, a typical example of asRNA regulation is X chromosome inactivation. Xist, an asRNA, can recruit polycomb repressive complex 2 (PRC2) which results in heterochromatinization of the X chromosome. In terms of epigenetic modification, cis acting refers to the nature of these asRNAs that regulate epigenetic changes around the loci where they are transcribed. Instead of targeting individual mRNAs, these cis acting epigenetic regulators can recruit chromatin modifying enzymes which can exert effects on both the transcription loci and the neighboring genes. hemoglobin alpha1 gene (HBA1) is downregulated by an abnormal transcript of putative RNA binding protein Luc7 like (LUC71) that serves as an asRNA to HBA1 and induces methylation of HBA1's promoter. Evidence has shown histone methylation can be induced by asRNAs. For instance, ANRIL, in addition to the ability to induce DNA methylation, can also repress the neighboring gene of CDKN2B, CDKN2A, by recruiting polycomb repressive complex 2 (PRC2) which leads to histone methylation (H3K27me). Another classic example is X chromosome inactivation by XIST. First of all, asRNAs and antagoNATs can be easily degraded by RNase or other degrading enzymes. To prevent degradation of the therapeutic oliogoneucleotides, chemical modification is usually required. The most common chemical modification on the oligonucleotides is adding a phosphorothioate linkage to the backbones. However, the phosphrothioate modification can be proinflammatory. Adverse effects including fever, chills or nausea have been observed after local injection of phosphrothioate modified oligonucleotides. Secondly, off target toxicity also represents a big problem. Despite the locus specific nature of the endogenous asRNAs, only 10–50% synthesized oligonucleotides showed expected targeting effect. One possible reason for this problem is the high requirement on the structure of the asRNAs to be recognized by the target sequence and RNase H. A single mismatch can result in distortion in the secondary structure and lead to off target effects. Lastly, artificial asRNAs have been shown to have limited intracellular uptake. Although neurons and glia have been shown to have the ability to freely uptake naked antisense oligonucleotides, a traceable carriers such as virus and lipid vesicles would still be ideal to control and monitor the intracellular concentration and metabolism.