Метод гемагглютинации: количественное определение вирусов и бактерий.

Введение

Измерение концентрации вирусов или бактерий

Метод гемагглютинации (ГА) и метод ингибирования гемагглютинации (ГИ или ГАИ) были разработаны в 1941–1942 годах американским вирусологом Джорджем Хирстом как методы количественной оценки относительной концентрации вирусов, бактерий или антител. ГА и ГАИ основаны на процессе гемагглютинации, при котором рецепторы сиаловой кислоты на поверхности эритроцитов связываются с гемагглютинином – гликопротеином, присутствующим на поверхности вируса гриппа (и ряда других вирусов) – и образуют сеть или решетчатую структуру, состоящую из соединенных между собой эритроцитов и вирусных частиц. Образованная решетка поддерживает эритроциты во взвешенном состоянии, что обычно выглядит как диффузный красноватый раствор. Формирование решетки зависит от концентраций вируса и эритроцитов, и если относительная концентрация вируса слишком низкая, эритроциты не удерживаются решеткой и оседают на дно лунки. Гемагглютинация наблюдается в присутствии стафилококков, вибрионов и других видов бактерий, по механизму схожему с тем, который используют вирусы для агглютинации эритроцитов. Эритроциты, используемые в анализах ГА и ГИ, обычно получают из крови кур, индеек, лошадей, морских свинок или людей, в зависимости от специфичности целевого вируса или бактерии и соответствующих поверхностных рецепторов на эритроцитах.

Процедура

Общая процедура для ХА выглядит следующим образом: серийное разбавление вируса готовится по рядам в U- или V-образной 96-луночной микротитрационной пластине. Наиболее концентрированный образец в первом колодце часто разбавляется до 1/5 от исходного, а последующие колодцы обычно имеют двукратные разведения (1/10, 1/20, 1/40 и т. д.). Последний колодец служит отрицательным контролем без вируса. Обычно каждый ряд пластины содержит другой вирус и одинаковую схему разведений. После серийных разведений в каждый колодец добавляется стандартизированная концентрация эритроцитов и аккуратно перемешивается. Пластину инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации анализ проводится для дифференциации агглютинированных и неагглютинированных колодцев. Изображения по ряду обычно показывают переход от агглютинированных колодцев с высокой концентрацией вируса и диффузным красноватым оттенком к ряду колодцев с низкой концентрацией вируса, содержащих темно-красный осадок или кнопку в центре колодца. Колодца с низкой концентрацией вируса выглядят почти идентично колодцам отрицательного контроля. Образование кнопки происходит потому, что эритроциты не удерживаются в агглютинированной решетчатой структуре и оседают в самой низкой точке U- или V-образной лунки. Переход от агглютинированных к неагглютинированным колодцам происходит четко, в пределах 1-2 колодцев. Относительная концентрация или титр вирусного образца определяется по последнему колодцу, в котором наблюдается агглютинация, непосредственно перед образованием осадка. По отношению к исходной концентрации вируса, концентрация вируса в этом колодце будет представлять собой определенное разведение исходного раствора, например, 1/40. Титр этого образца является обратным значением разведения, то есть 40. В некоторых случаях вирус изначально настолько разбавлен, что агглютинированные колодцы не наблюдаются. В этом случае титр этих образцов обычно устанавливается на уровне 5, что указывает на максимально возможную концентрацию, однако точность этого значения, очевидно, низка. В качестве альтернативы, если относительная концентрация вируса чрезвычайно высока и колодцы никогда не переходят в состояние осадка, титр обычно устанавливается на уровне самого высокого разведения, например, 5120. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) тесно связана с анализом ХА, но включает антивирусные антитела в качестве «ингибиторов», которые препятствуют взаимодействию вируса с эритроцитами. Цель состоит в том, чтобы определить концентрацию антител в антисыворотке или других образцах, содержащих антитела. РТГА обычно проводится путем создания серии разведений антисыворотки по рядам 96-луночной микротитрационной пластины. Обычно каждый ряд представляет собой отдельный образец. В каждый колодец добавляется стандартизированное количество вируса или бактерий, и смесь инкубируется при комнатной температуре в течение 30 минут. Последний колодец в каждом ряду служит отрицательным контролем без добавления вируса. Во время инкубации антитела связываются с вирусными частицами, и если концентрация и аффинность связывания антител достаточно высоки, вирусные частицы эффективно блокируются от вызывания гемагглютинации. Затем в каждый колодец добавляется стандартизированное количество эритроцитов и инкубируется при комнатной температуре еще в течение 30 минут. Полученные изображения пластин РТГА обычно показывают переход от неагглютинированных колодцев с «кнопкой» и высокой концентрацией антител к агглютинированным колодцам с диффузным красным оттенком и низкой концентрацией антител. Титр РТГА является обратным значением последнего разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Предыдущие описания процессов ХА и РТГА являются обобщенными, и конкретные детали могут варьироваться в зависимости от оператора и лаборатории. Например, описаны серийные разведения по рядам, но некоторые лаборатории используют альтернативную ориентацию и выполняют разведения по колонкам. Аналогично, начальное разведение, коэффициент серийного разведения, время инкубации и выбор U- или V-образной пластины могут зависеть от конкретной лаборатории.

A general procedure for HA is as follows, a serial dilution of virus is prepared across the rows in a U or V bottom shaped 96 well microtiter plate. The most concentrated sample in the first well is often diluted to be 1/5x of the stock, and subsequent wells are typically two fold dilutions (1/10, 1/20, 1/40, etc.). The final well serves as a negative control with no virus. Each row of the plate typically has a different virus and the same pattern of dilutions. After serial dilutions, a standardized concentration of RBCs is added to each well and mixed gently. The plate is incubated for 30 minutes at room temperature. Following the incubation period, the assay can be analyzed to distinguish between agglutinated and non agglutinated wells. The images across a row will typically progress from agglutinated wells with high virus concentration and a diffuse reddish appearance to a series of wells with low virus concentrations containing a dark red pellet, or button, in the center of the well. The low concentration wells appear nearly identical to the no virus negative control well. The button appearance occurs because the RBCs are not held in the agglutinated lattice structure and settle into the low point of the U or V bottom well. The transition from agglutinated to non agglutinated wells occurs distinctively, within 1 to 2 wells. The relative concentration, or titer, of the virus sample is based on the well with the last agglutinated appearance, immediately before a pellet is observed. Relative to the initial viral stock concentration, the virus concentration in this well will be some dilution of the stock, for example, 1/40 fold. The titer value of that sample is the inverse of the dilution, i. e., 40. In some cases, the virus is initially so dilute that agglutinated wells are never observed. In that case, the titer of these samples is commonly assigned as 5, indicating the highest possible concentration, but the accuracy of that value is clearly low. Alternatively, if the relative concentration of the virus is extremely high and the wells never transition to a button appearance. The titer value is then commonly assigned to be the highest dilution, such as 5120. HI is closely related to the HA assay, but includes anti viral antibodies as “inhibitors” to interfere with the virus RBC interaction. The goal is to characterize the concentration of antibodies in the antiserum or other samples containing antibodies. The HI assay is generally performed by creating a dilution series of antiserum across the rows of a 96 well microtiter plate. Each row would usually be a different sample. A standardized amount of virus or bacteria is added to each well, and the mixture is allowed to incubate at room temperature for 30 minutes. The last well in each row would be a negative control with no virus added. During the incubation, antibodies bind to the viral particles, and if the concentration and binding affinity of the antibodies are high enough, the viral particles are effectively blocked from causing hemagglutination. Next, a standardized amount of RBCs is added to each well and allowed to incubate at room temperature for an additional 30 minutes. The resulting HI plate images usually progress from non agglutinated, “button” wells with high antibody concentration to agglutinated, red diffuse wells with low antibody concentration. The HI titer value is the inverse of the last dilution of serum that completely inhibited hemagglutination. The preceding descriptions of the HA and HI processes are generalized, and specific details can vary depending on the operator and laboratory. For example, serial dilutions across the rows is described, but some laboratories use an alternate orientation and perform dilutions down the columns instead. Similarly, the starting dilution, serial dilution factor, incubation times, and choice of U or V bottom plate can depend on the specific laboratory.

Преимущества

HA и HI обладают преимуществами, такими как простота проведения, использование относительно недорогого и доступного оборудования и расходных материалов, а также получение результатов в течение нескольких часов. Эти анализы широко распространены и хорошо зарекомендовали себя во многих лабораториях мира, что обеспечивает определенную степень достоверности, возможность сравнения и стандартизации.

Ограничения

Для получения оптимальных и достоверных результатов необходимо контролировать ряд переменных, таких как время инкубации, концентрация эритроцитов и тип эритроцитов. Неспецифические факторы в образце могут вызывать интерференцию и приводить к неверным значениям титра. Например, молекулы в образце, отличные от вирус-специфических антител, могут ингибировать агглютинацию между вирусом и эритроцитами, а также потенциально блокировать связывание антител с вирусом. Рецептор-разрушающие ферменты (РДЭ) обычно используются для предварительной обработки образцов перед анализом, чтобы предотвратить неспецифическое ингибирование. Анализ результатов гемагглютинации (HA) или торможения гемагглютинации (HI) требует квалифицированного специалиста для оценки результатов и определения значений титра. Ручная интерпретация результатов увеличивает вероятность расхождений в анализе, поскольку результаты могут быть субъективными, а согласованность между разными оценщиками непостоянна. Кроме того, отсутствует цифровая запись данных о пластине или определении титра, поэтому первоначальная интерпретация трудоемка и обычно выполняется в повторностях. Широкий спектр потенциальных переменных и различия в оценках экспертов могут затруднить сравнение результатов, полученных в разных лабораториях.