Цитохром c оксидаза: структура, функция и ингибирование.

Введение

Сложный фермент, обнаруженный в бактериях, археях и митохондриях эукариотов.

Фермент цитохром c оксидаза, или Комплекс IV (ранее классифицировался, а теперь переклассифицирован как транслоказа EC 7.1.1.9), представляет собой крупный трансмембранный белковый комплекс, обнаруженный в бактериях, археях и митохондриях эукариотов. Он является последним ферментом в цепи транспорта электронов дыхания, расположенной в мембране. Он принимает электрон от каждой из четырех молекул цитохрома c и передает их одной молекуле кислорода и четырем протонам, в результате чего образуются две молекулы воды. Помимо связывания четырех протонов из внутренней водной фазы, он транспортирует еще четыре протона через мембрану, увеличивая трансмембранную разницу электрохимического потенциала протонов, которую затем АТФ-синтаза использует для синтеза АТФ.

Сборка

Сборка COX у дрожжей – сложный процесс, который до конца не изучен из-за быстрого и необратимого агрегирования гидрофобных субъединиц, формирующих голоэнзимный комплекс, а также агрегирования мутантных субъединиц с обнаженными гидрофобными участками. Кофакторы, включая гемы, внедряются в субъединицы I и II. Две молекулы гема находятся в субъединице I, способствуя их транспорту в субъединицу II, где две молекулы меди помогают в дальнейшей передаче электронов. Сборка инициируется субъединицами I и IV. Различные субъединицы могут ассоциировать, образуя промежуточные субкомплексы, которые впоследствии связываются с другими субъединицами, формируя COX-комплекс, играющий ключевую роль в стабилизации голоэнзимного комплекса. Диссоциация субъединиц VIIa и III в сочетании с удалением кардиолипина приводит к полной потере ферментативной активности. Несмотря на то, что взаимодействия между субъединицами I, II и III, закодированными в митохондриальном геноме, вносят меньший вклад в стабильность фермента, чем взаимодействия между бигеномными субъединицами, эти субъединицы более консервативны, что указывает на потенциальные, еще не исследованные роли в ферментативной активности.

Ингибирование

COX существует в трех конформационных состояниях: полностью окисленном (пульсирующем), частично восстановленном и полностью восстановленном. Каждый ингибитор обладает высоким сродством к определенному состоянию. В пульсирующем состоянии окислены как гемовый a, так и биядерный Cu центры; это конформация фермента с наивысшей активностью. Восстановление двух электронов инициирует конформационное изменение, позволяющее кислороду связываться в активном центре с частично восстановленным ферментом. Четыре электрона связываются с COX для полного восстановления фермента. Его полностью восстановленное состояние, состоящее из восстановленного Fe в гемовой группе цитохрома a и восстановленного биядерного Cu центра, считается неактивным или покоящимся состоянием фермента. Цианид, азид и оксид углерода связываются с цитохром c оксидазой, ингибируя функцию белка и приводя к химической асфиксии клеток. Для компенсации увеличения концентрации ингибитора требуются более высокие концентрации молекулярного кислорода, что приводит к общему снижению метаболической активности в клетке в присутствии ингибитора. Другие лиганды, такие как оксид азота и сероводород, также могут ингибировать COX, связываясь с регуляторными участками фермента и снижая скорость клеточного дыхания. Цианид является неконкурентным ингибитором COX, обладающим высоким сродством к частично восстановленному состоянию фермента и препятствующим его дальнейшему восстановлению. В пульсирующем состоянии цианид связывается медленно, но с высоким сродством. Предполагается, что лиганд электростатически стабилизирует оба металла одновременно, располагаясь между ними. Высокая концентрация оксида азота, например, добавленная к ферменту извне, обращает вспять цианидное ингибирование COX. Оксид азота может обратимо связываться с любым из ионов металла в биядерном центре, окисляясь до нитрита. NO и CN конкурируют с кислородом за связывание в этом месте, снижая скорость клеточного дыхания. Однако эндогенный NO, который образуется в меньших количествах, усиливает ингибирование CN. Более высокие уровни NO, коррелирующие с большим количеством фермента в восстановленном состоянии, приводят к более сильному ингибированию цианида.

COX exists in three conformational states: fully oxidized (pulsed), partially reduced, and fully reduced. Each inhibitor has a high affinity to a different state. In the pulsed state, both the heme a and the Cu nuclear centers are oxidized; this is the conformation of the enzyme that has the highest activity. A two electron reduction initiates a conformational change that allows oxygen to bind at the active site to the partially reduced enzyme. Four electrons bind to COX to fully reduce the enzyme. Its fully reduced state, which consists of a reduced Fe at the cytochrome a heme group and a reduced Cu binuclear center, is considered the inactive or resting state of the enzyme. Cyanide, azide, and carbon monoxide all bind to cytochrome c oxidase, inhibiting the protein from functioning and leading to the chemical asphyxiation of cells. Higher concentrations of molecular oxygen are needed to compensate for increasing inhibitor concentrations, leading to an overall decrease in metabolic activity in the cell in the presence of an inhibitor. Other ligands, such as nitric oxide and hydrogen sulfide, can also inhibit COX by binding to regulatory sites on the enzyme, reducing the rate of cellular respiration. Cyanide is a non competitive inhibitor for COX, binding with high affinity to the partially reduced state of the enzyme and hindering further reduction of the enzyme. In the pulsed state, cyanide binds slowly, but with high affinity. The ligand is posited to electrostatically stabilize both metals at once by positioning itself between them. A high nitric oxide concentration, such as one added exogenously to the enzyme, reverses cyanide inhibition of COX. Nitric oxide can reversibly bind to either metal ion in the binuclear center to be oxidized to nitrite. NO and CN will compete with oxygen to bind at the site, reducing the rate of cellular respiration. Endogenous NO, however, which is produced at lower levels, augments CN inhibition. Higher levels of NO, which correlate with the existence of more enzyme in the reduced state, lead to a greater inhibition of cyanide.

Экстрамитохондриальные и субклеточные локализации

Цитохром c-оксидаза состоит из 3 субъединиц, кодируемых митохондриальной ДНК (субъединицы I, II и III цитохром c-оксидазы). Из этих 3 субъединиц, кодируемых митохондриальной ДНК, две были обнаружены в экстрамитохондриальных локализациях. В ацинарной ткани поджелудочной железы эти субъединицы были найдены в гранулах зимогена. Кроме того, в передней доле гипофиза относительно большое количество этих субъединиц было обнаружено в гранулах, секретирующих гормон роста. Функции этих субъединиц цитохрома c-оксидазы вне митохондрий пока не изучены. Помимо субъединиц цитохрома c-оксидазы, экстрамитохондриальная локализация наблюдается и для большого числа других митохондриальных белков. Это наводит на мысль о существовании пока не идентифицированных специфических механизмов для транслокации белков из митохондрий в другие клеточные компартменты.

Генетические дефекты и нарушения

Дефекты, связанные с генетическими мутациями, изменяющими функциональность или структуру цитохром c оксидазы (COX), могут приводить к тяжелым, часто смертельным нарушениям метаболизма. Эти нарушения обычно проявляются в раннем детстве и преимущественно поражают ткани с высокими энергетическими потребностями (мозг, сердце, мышцы). Среди множества классифицированных митохондриальных заболеваний, наиболее тяжелыми считаются те, которые связаны с нарушением сборки COX. Подавляющее большинство нарушений, связанных с COX, обусловлены мутациями в ядерных генах, кодирующих белки, известные как факторы сборки или сборочные белки. Эти факторы сборки вносят вклад в структуру и функциональность COX и участвуют в нескольких важных процессах, включая транскрипцию и трансляцию митохондриально кодируемых субъединиц, процессинг препротеинов и их встраивание в мембрану, а также биосинтез и включение кофакторов. На сегодняшний день мутации были идентифицированы в семи факторах сборки COX: SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX15, COX20, COA5 и LRPPRC. Мутации в этих белках могут приводить к нарушению функциональности сборки субкомплексов, транспорта меди или регуляции трансляции. Каждая мутация гена связана с этиологией конкретного заболевания, при этом некоторые из них могут быть вовлечены в развитие нескольких заболеваний. К заболеваниям, связанным с нарушением сборки COX вследствие мутаций генов, относятся синдром Ли, кардиомиопатия, лейкодистрофия, анемия и сенсоневральная глухота.

Гистохимия

Увеличение зависимости нейронов от окислительного фосфорилирования для получения энергии облегчает использование гистохимии COX для картирования регионального метаболизма мозга у животных, поскольку это устанавливает прямую и положительную корреляцию между активностью фермента и нейронной активностью. Это проявляется в корреляции между количеством фермента COX и его активностью, что свидетельствует о регуляции COX на уровне экспрессии генов. Распределение COX различается в разных областях мозга животных, однако паттерн его распределения сохраняется у разных особей. Этот паттерн наблюдался в мозге обезьян, мышей и телят. В гистохимическом анализе мозга последовательно обнаруживается один изозим COX. С помощью этой методики было проведено картирование мозга у спонтанных мутантных мышей с заболеваниями мозжечка, таких как reeler, и у трансгенной модели болезни Альцгеймера. Также этот метод использовался для картирования активности, связанной с обучением, в мозге животных.