Введение

Метод визуализации на основе флуоресценции

Флуоресцентная визуализационная микроскопия, или FLIM, – это метод визуализации, основанный на различиях в скорости экспоненциального затухания флуоресцентного излучения от флуорофора в образце. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии, микроскопии с двухфотонным возбуждением и мультифотонной томографии. В FLIM для создания изображения используется время жизни флуоресценции (FLT) флуорофора, а не его интенсивность. Время жизни флуоресценции зависит от локальной микросреды флуорофора, что исключает ошибочные измерения интенсивности флуоресценции, вызванные изменением яркости источника света, интенсивности фонового излучения или ограниченным фотовыцветанием. Этот метод также имеет преимущество в минимизации влияния рассеяния фотонов в толстых слоях образца. Благодаря зависимости от микросреды, измерения времени жизни используются в качестве индикатора pH, вязкости и концентрации химических веществ.

Измерение

Флуоресцентная визуализация времени жизни создает изображения, в которых интенсивность каждого пикселя определяется временем жизни флуоресценции, что позволяет визуализировать контраст между материалами с различными константами скорости флуоресцентного распада (даже если эти материалы флуоресцируют на одной и той же длине волны), а также получать изображения, отражающие изменения в других путях распада, например, при визуализации FRET.

Импульсное освещение

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области, используя импульсный источник. Когда популяция флюорофоров возбуждается ультракоротким или дельта-импульсом света, флуоресценция, разрешенная по времени, будет затухать экспоненциально, как описано выше. Однако, если импульс возбуждения или отклик детектора имеют большую длительность, измеренная флуоресценция, d(t), не будет чисто экспоненциальной. Функция инструментального отклика IRF(t) будет свертка или смешиваться с функцией затухания F(t). Инструментальный отклик источника, детектора и электроники можно измерить, обычно по рассеянному возбуждающему свету. Восстановление функции затухания (и соответствующих времен жизни) представляет собой дополнительные трудности, поскольку деление в частотной области склонно приводить к высокому уровню шума, когда знаменатель близок к нулю.

TCSPC

Временное коррелированное подсчет одиночных фотонов (TCSPC) обычно используется, поскольку он компенсирует изменения интенсивности источника и амплитуды одиночных фотонных импульсов. С помощью коммерческого оборудования TCSPC можно зарегистрировать кривую затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс. Зарегистрированная гистограмма затухания флуоресценции подчиняется статистике Пуассона, которая учитывается при оценке качества аппроксимации при подгонке. В частности, TCSPC регистрирует моменты времени, когда отдельные фотоны детектируются быстрым детектором одиночных фотонов (обычно фотоэлектронным умножителем (PMT) или лавинным фотодиодом с одиночным фотоном (SPAD)) относительно импульса возбуждающего лазера. Регистрация повторяется для множества лазерных импульсов, и после накопления достаточного количества событий можно построить гистограмму числа событий для всех зарегистрированных моментов времени. Затем эту гистограмму можно аппроксимировать экспоненциальной функцией, содержащей экспоненциальную функцию затухания, представляющую интерес, и, соответственно, извлечь параметр времени жизни. Многоканальные системы PMT с 16–64 элементами были коммерчески доступны, в то время как недавно разработанные системы CMOS TCSPC FLIM с лавинными фотодиодами с одиночным фотоном (SPAD) могут предложить еще большее количество каналов детектирования и дополнительные экономичные решения.

Метод ограждения

В этом методе до сих пор используется импульсное возбуждение. Перед тем, как импульс достигает образца, часть света отражается дихроическим зеркалом и регистрируется фотодиодом, который активирует генератор задержки, управляющий воротным оптическим усилителем (GOI), расположенным перед CCD-детектором. GOI обеспечивает регистрацию только в течение того короткого промежутка времени, когда он открыт после задержки. Таким образом, с помощью регулируемого генератора задержки можно регистрировать флуоресцентную эмиссию после различных задержек, охватывающих временной диапазон флуоресцентного затухания образца. В последние годы на рынок поступили интегрированные усиленные CCD-камеры. Эти камеры состоят из усилителя изображения, CCD-сенсора и интегрированного генератора задержки. ICCD-камеры с минимальным временем открытия до 200 пс и шагами задержки 10 пс обеспечивают разрешение FLIM менее наносекунды. В сочетании с эндоскопом эта техника используется для интраоперационной диагностики опухолей мозга.

Фазовая модуляция

Время жизни флуоресценции может быть определено в частотной области методом фазовой модуляции. Метод использует источник света, который импульсирует или модулируется на высокой частоте (до 500 МГц), например, светодиод, диодный лазер или источник непрерывной волны в сочетании с электрооптическим или акустооптическим модулятором. Флуоресценция (a) демодулируется и (b) претерпевает фазовый сдвиг; оба этих параметра связаны с характерными временами затухания флуорофора. Кроме того, компоненты амплитуды синусоидальных волн возбуждения и флуоресценции также модулируются, и время жизни можно определить по отношению модуляции этих амплитуд. Таким образом, методом фазовой модуляции можно определить два значения времени жизни. Определение времени жизни осуществляется посредством подгонки этих экспериментальных параметров. Преимуществом FLIM в частотной области, основанного на фотоумножителях или камерах, является быстрое получение изображений времени жизни, что делает его подходящим для таких приложений, как исследование живых клеток.

Приложения

FLIM в основном используется в биологии как метод обнаружения фотосенсибилизаторов в клетках и опухолях, а также FRET в тех случаях, когда рациометрическая визуализация затруднена. Метод был разработан в конце 1980-х – начале 1990-х годов (метод Гейтинга: Bugiel et al., 1989; König, 1989; фазовая модуляция: Lakowicz et al., 1992) и получил более широкое распространение в конце 1990-х годов. В клеточных культурах он применялся для изучения сигнализации и транспорта рецепторов EGF. FLIM во временной области (tdFLIM) также использовался для демонстрации взаимодействия двух типов ядерных промежуточных филаментов – ламинов A и B1 – в различных гомополимерах на ядерной оболочке, которые, в свою очередь, взаимодействуют друг с другом, формируя структуры более высокого порядка. FLIM-визуализация особенно полезна при изучении нейронов, где рассеивание света мозговой тканью затрудняет рациометрическую визуализацию. В нейронах FLIM-визуализация с использованием импульсного освещения применялась для изучения белков семейств Ras, CaMKII, Rac и Ran. FLIM использовался в клинической мультифотонной томографии для обнаружения внутрикожных раковых клеток, а также фармацевтических и косметических соединений. В последнее время FLIM также применяется для обнаружения флаванолов в растительных клетках.

Автофлуоресцентные коэнзимы NAD ((P) H и FAD

Многофотонный FLIM все чаще используется для выявления аутофлуоресценции коферментов в качестве маркеров изменений метаболизма млекопитающих.

Изображение FRET

Поскольку время жизни флуорофора зависит как от радиационных (то есть флуоресценции), так и от нерадиационных (то есть гашения, FRET) процессов, передача энергии от донорной молекулы к акцепторной молекуле сокращает время жизни донора. Таким образом, измерения FRET с использованием FLIM предоставляют метод для различения состояний и окружения флуорофора. В отличие от измерений FRET, основанных на интенсивности, измерения FRET на основе FLIM также нечувствительны к концентрации флуорофоров и, следовательно, позволяют исключить артефакты, возникающие из-за изменений концентрации и интенсивности эмиссии по всему образцу.