Введение
Восстановление флуоресценции после фотообеливания (FRAP) – это метод определения кинетики диффузии в тканях или клетках. Он позволяет количественно оценить двумерную латеральную диффузию молекулярно тонкой пленки, содержащей флуоресцентно меченые зонды, или исследовать отдельные клетки. Эта методика очень полезна в биологических исследованиях диффузии клеточных мембран и связывания белков. Кроме того, поверхностное осаждение флуоресцирующего фосфолипидного бислоя (или монослоя) позволяет характеризовать гидрофильные (или гидрофобные) поверхности с точки зрения их структуры и свободной энергии. Существуют также подобные, хотя и менее известные, методы, разработанные для изучения трехмерной диффузии и связывания молекул внутри клетки; они также обозначаются как FRAP.
Экспериментальная установка
Основной аппарат состоит из оптического микроскопа, источника света и флуоресцентного зонда. Флуоресцентная эмиссия обусловлена поглощением определенной оптической длины волны или цвета, что ограничивает выбор ламп. Чаще всего используется источник ртути или ксенона широкого спектра в сочетании с цветовым фильтром. Техника начинается с сохранения фонового изображения образца перед фотообесцвечиванием. Затем источник света фокусируется на небольшом участке видимой области либо переключением на объектив микроскопа с большим увеличением, либо с помощью лазерного света соответствующей длины волны. Флюорофоры в этой области получают интенсивное освещение, которое приводит к быстрому завершению их времени жизни флуоресценции (ограниченному примерно 105 фотонами до затухания). Теперь изображение в микроскопе представляет собой однородное флуоресцентное поле с заметным темным пятном. По мере протекания броуновского движения, все еще флуоресцирующие зонды будут диффундировать по образцу, замещая обесцвеченные зонды в отбеленной области. Эта диффузия происходит упорядоченно и может быть аналитически определена из уравнения диффузии. При условии гауссова профиля отбеливающего луча, константу диффузии D можно просто рассчитать по формуле:
где w – радиус луча, а tD – «характерное» время диффузии.
Поддерживаемые липидные бислои
Первоначально метод FRAP был разработан для определения подвижности отдельных молекул липидов в клеточной мембране. Если изучаемый белок экспрессируется с использованием GFP, то можно отслеживать флуоресценцию. Фотообесцвечивание GFP с последующим наблюдением за восстановлением флуоресценции в обесцвеченной области позволяет получить информацию о взаимодействующих белках, непрерывности органелл и транспорте белков. Если через некоторое время флуоресценция не возвращается к исходному уровню, это указывает на наличие неподвижной фракции (которая не может быть восполнена диффузией). Аналогично, если флуоресцентные белки связываются со статичными клеточными рецепторами, скорость восстановления будет замедляться в зависимости от коэффициентов ассоциации и диссоциации связывания. Это наблюдение в последнее время используется для изучения связывания белков. Кроме того, если белок, меченный GFP, постоянно входит в состав более крупного комплекса, динамика восстановления флуоресценции будет определяться диффузией этого комплекса.
Применение вне мембраны
FRAP также может быть использован для мониторинга белков вне мембраны. После того, как интересующий белок становится флуоресцентным, обычно путем экспрессии в виде белка-слияния с GFP, конфокальный микроскоп используется для фотообесцвечивания и мониторинга области цитоплазмы. Средняя флуоресценция в области затем может быть представлена в виде графика зависимости от времени после фотообесцвечивания, и полученная кривая может дать кинетические коэффициенты, такие как коэффициенты реакций связывания белка и/или коэффициент диффузии белка в среде, в которой он изучается. Часто рассматриваемой динамикой являются только диффузия и взаимодействия связывания/диссоциации, однако, в принципе, белки также могут перемещаться посредством потока, то есть испытывать направленное движение, и это было признано очень рано Axelrod и др. (что включает в себя модифицированные функции Бесселя и ) с характерным временным масштабом для диффузии, и – время. – это нормализованная флуоресценция (стремится к 1 при стремящемся к бесконечности). Временной масштаб диффузии для обесцвеченного пятна радиуса равен , где D – коэффициент диффузии. Следует отметить, что это справедливо для мгновенного обесцвечивания с профилем ступенчатой функции, то есть доля белка, которая предположительно обесцвечивается мгновенно в момент времени , равна , и , для – расстояние от центра обесцвеченной области. Также предполагается, что восстановление может быть смоделировано диффузией в двух измерениях, то есть также однородной и изотропной. Другими словами, диффузия происходит в однородной среде, поэтому эффективная константа диффузии D одинакова везде, и диффузия является изотропной, то есть происходит с одинаковой скоростью по всем осям в плоскости. На практике ни одно из этих предположений в клетке строго не выполняется. Обесцвечивание не будет мгновенным. Особенно если требуется сильное обесцвечивание большой площади, обесцвечивание может занять значительную часть диффузионного временного масштаба. Тогда значительная часть обесцвеченного белка будет диффундировать из обесцвеченной области уже во время обесцвечивания. Неучет этого внесет существенную ошибку в значение D. Профиль обесцвечивания не будет радиальной ступенчатой функцией. Если обесцвеченное пятно фактически представляет собой один пиксель, то обесцвечивание как функция положения обычно будет ограничено дифракцией и определяться оптикой используемого конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Это не радиальная ступенчатая функция и также изменяется вдоль оси, перпендикулярной плоскости. Клетки, конечно, трехмерны, а не двумерны, как и объем обесцвечивания. Игнорирование диффузии из плоскости (мы принимаем это за плоскость xy) будет разумным приближением только в том случае, если восстановление флуоресценции происходит преимущественно за счет диффузии в этой плоскости. Это будет верно, например, если цилиндрический объем обесцвечивается с осью цилиндра вдоль оси z и этот цилиндрический объем проходит через всю высоту клетки. Тогда диффузия вдоль оси z не вызывает восстановления флуоресценции, поскольку весь белок обесцвечивается равномерно вдоль оси z, и поэтому игнорирование этого, как это делает уравнение Сумпасиса, безопасно. Однако, если диффузия вдоль оси z вносит вклад в восстановление флуоресценции, ее необходимо учитывать. Нет оснований ожидать, что цитоплазма или нуклеоплазма клетки будут полностью пространственно однородными или изотропными. Таким образом, уравнение Сумпасиса является лишь полезным приближением, которое можно использовать, когда вышеуказанные предположения являются хорошим приближением к реальной ситуации, и когда восстановление флуоресценции действительно ограничено диффузионным временным масштабом. Следует отметить, что только потому, что уравнение Сумпасиса может быть адекватно подогнано к данным, не обязательно означает, что предположения верны и что диффузия доминирует в восстановлении.
with the characteristic timescale for diffusion, and is the time. is the normalized fluorescence (goes to 1 as goes to infinity). The diffusion timescale for a bleached spot of radius is , with D the diffusion coefficient. Note that this is for an instantaneous bleach with a step function profile, i. e., the fraction of protein assumed to be bleached instantaneously at time is , and , for is the distance from the centre of the bleached area. It is also assumed that the recovery can be modelled by diffusion in two dimensions, that is also both uniform and isotropic. In other words, that diffusion is occurring in a uniform medium so the effective diffusion constant D is the same everywhere, and that the diffusion is isotropic, i. e., occurs at the same rate along all axes in the plane. In practice, in a cell none of these assumptions will be strictly true. Bleaching will not be instantaneous. Particularly if strong bleaching of a large area is required, bleaching may take a significant fraction of the diffusion timescale Then a significant fraction of the bleached protein will diffuse out of the bleached region actually during bleaching. Failing to take account of this will introduce a significant error into D.
The bleached profile will not be a radial step function. If the bleached spot is effectively a single pixel then the bleaching as a function of position will typically be diffraction limited and determined by the optics of the confocal laser scanning microscope used. This is not a radial step function and also varies along the axis perpendicular to the plane. Cells are of course three dimensional not two dimensional, as is the bleached volume. Neglecting diffusion out of the plane (we take this to be the xy plane) will be a reasonable approximation only if the fluorescence recovers predominantly via diffusion in this plane. This will be true, for example, if a cylindrical volume is bleached with the axis of the cylinder along the z axis and with this cylindrical volume going through the entire height of the cell. Then diffusion along the z axis does not cause fluorescence recovery as all protein is bleached uniformly along the z axis, and so neglecting it, as Soumpasis' equation does, is harmless. However, if diffusion along the z axis does contribute to fluorescence recovery then it must be accounted for. There is no reason to expect the cell cytoplasm or nucleoplasm to be completely spatially uniform or isotropic. Thus, the equation of Soumpasis is just a useful approximation, that can be used when the assumptions listed above are good approximations to the true situation, and when the recovery of fluorescence is indeed limited by the timescale of diffusion Note that just because the Soumpasis can be fitted adequately to data does not necessarily imply that the assumptions are true and that diffusion dominates recovery.
Восстановление с ограниченной реакцией
Уравнение, описывающее флуоресценцию как функцию времени, особенно просто в другом предельном случае. Если большое количество белков связывается с участками в малом объеме, так что флуоресцентный сигнал в этом объеме определяется преимущественно сигналом от связанных белков, и если это связывание происходит в одном состоянии с константой диссоциации koff, то флуоресценция как функция времени выражается следующим образом:
Следует отметить, что восстановление зависит только от константы скорости диссоциации koff и не зависит от константы скорости ассоциации. Хотя это зависит от ряда допущений, было показано, что кривые FRAP могут быть аппроксимированы различными парами значений константы диффузии и константы скорости ассоциации, то есть подгонка кривых FRAP не является однозначной. Это справедливо для аппроксимации в трех параметрах (константа скорости ассоциации, константа скорости диссоциации и константа диффузии). Неоднозначные подгонки, как правило, не имеют практической ценности. Таким образом, для моделей с несколькими параметрами одного эксперимента FRAP может быть недостаточно для оценки всех параметров модели. В этом случае требуются дополнительные данные, например, отбеливание областей разного размера, независимое определение некоторых параметров модели и т.д.