Гемоцианины: белки переноса кислорода у беспозвоночных.

Введение

Белки, переносящие кислород по телам некоторых беспозвоночных животных.

Гемоцианины (также пишутся гемоцианины и сокращаются Hc) – это белки, переносящие кислород по телам некоторых беспозвоночных животных. Эти металлопротеины содержат два атома меди, которые обратимо связывают одну молекулу кислорода (O2). Они уступают по частоте использования в качестве молекулы, транспортирующей кислород, только гемоглобину. В отличие от гемоглобина, содержащегося в красных кровяных клетках позвоночных, гемоцианины не заключены в клетки крови, а находятся непосредственно во взвешенном состоянии в гемолимфе. Окисление вызывает изменение цвета от бесцветной Cu(I)-дезоксигенированной формы до синей Cu(II)-оксигенированной формы.

Распределение видов

Гемоцианин был впервые обнаружен в Octopus vulgaris Леоном Фредериком в 1878 году. Присутствие меди в моллюсках было выявлено еще раньше Бартоломео Бицио в 1833 году. Гемоцианины встречаются у моллюсков и членистоногих, включая головоногих и ракообразных, и используются некоторыми наземными членистоногими, такими как тарантул Eurypelma californicum, императорский скорпион и сколопендра Scutigera coleoptrata. Также, запасающие белки личинок у многих насекомых, по-видимому, имеют происхождение от гемоцианинов.

Суперсемейство гемоцианинов

Суперсемейство гемоцианинов членистоногих состоит из фенолоксидаз, гексамеринов, псевдогемоцианинов или криптоцианинов и (диптерных) гексамериновых рецепторов. Фенолоксидазы – это содержащие медь тирозиназы. Эти белки участвуют в процессе склеротизации кутикулы членистоногих, заживлении ран и гуморальном иммунном ответе. Фенолоксидазы синтезируются в виде зимогенов и активируются путем расщепления N-концевого пептида. Гексамерины – это запасающие белки, широко распространенные у насекомых. Эти белки синтезируются жировым телом личинок и связаны с циклами линьки или условиями питания. Генетические последовательности псевдогемоцианина и криптоцианина тесно связаны с гемоцианинами у ракообразных. Эти белки имеют сходную структуру и функцию, но лишены центров связывания меди. Эволюционные изменения в филогенезе суперсемейства гемоцианинов тесно связаны с возникновением этих различных белков у разных видов. Понимание белков, входящих в это суперсемейство, было бы неполным без обширных исследований гемоцианина у членистоногих.

Структура и механизм

Хотя дыхательная функция гемоцианина схожа с функцией гемоглобина, существует значительное количество различий в его молекулярной структуре и механизме. В то время как гемоглобин несет свои атомы железа в порфириновых кольцах (гемогруппы), атомы меди гемоцианина связаны как протезные группы, координируемые остатками гистидина. Каждый мономер гемоцианина удерживает пару катионов меди(I) на месте посредством взаимодействия с имидазольными кольцами шести остатков гистидина. Отмечено, что виды, использующие гемоцианин для транспорта кислорода, включают ракообразных, обитающих в холодных средах с низким парциальным давлением кислорода. В таких условиях транспорт кислорода гемоглобином менее эффективен, чем транспорт кислорода гемоцианином. Тем не менее, существуют также наземные членистоногие, использующие гемоцианин, в частности пауки и скорпионы, обитающие в теплых климатах. Молекула конформационно стабильна и полностью функционирует при температурах до 90 градусов Цельсия.

Большинство гемоцианинов связываются с кислородом некооперативно и примерно в четыре раза менее эффективны, чем гемоглобин, в транспорте кислорода на единицу объема крови. Гемоглобин связывает кислород кооперативно благодаря стерическим конформационным изменениям в белковом комплексе, что повышает аффинность гемоглобина к кислороду при частичном насыщении кислородом. В некоторых гемоцианинах лангустов и некоторых других видов членистоногих наблюдается кооперативное связывание с коэффициентами Хилла от 1,6 до 3,0. Коэффициенты Хилла варьируются в зависимости от вида и условий лабораторных измерений. Для сравнения, гемоглобин обычно имеет коэффициент Хилла от 2,8 до 3,0. В этих случаях кооперативного связывания гемоцианин организован в белковые субкомплексы из 6 субъединиц (гексамеры), каждая из которых имеет один сайт связывания кислорода; связывание кислорода с одной субъединицей в комплексе увеличивает аффинность соседних субъединиц. Каждый гексамерный комплекс организован вместе, образуя более крупный комплекс из десятков гексамеров. В одном исследовании было обнаружено, что кооперативное связывание зависит от организации гексамеров в более крупный комплекс, что указывает на кооперативное связывание между гексамерами. На профиль связывания гемоцианина с кислородом также влияют концентрации растворенных солей и pH. Гемоцианин состоит из множества отдельных белковых субъединиц, каждая из которых содержит два атома меди и может связывать одну молекулу кислорода (O2). Каждая субъединица весит около 75 килодальтон (кДа). Субъединицы могут быть организованы в димеры или гексамеры в зависимости от вида; димерный или гексамерный комплекс, в свою очередь, организован в цепи или кластеры весом более 1500 кДа. Субъединицы обычно гомогенны или гетерогенны, содержат два варианта типов субъединиц. Из-за большого размера гемоцианин обычно свободно плавает в крови, в отличие от гемоглобина. Гексамеры характерны для гемоцианинов членистоногих. Гемоцианин тарантула Eurypelma californicum состоит из 6 гексамеров или 36 цепей. У подковы крабов гемоцианин состоит из 8 гексамеров (т.е. 48 цепей). Простые гексамеры встречаются у омаров Panulirus interruptus и изопода Bathynomus giganteus. В обоих случаях сначала необходимо активировать неактивные предшественники ферментов (также называемые зимогенами или проферментами). Это достигается путем удаления аминокислоты, которая блокирует входной канал в активный центр, когда профермент неактивен. В настоящее время не известно других модификаций, необходимых для активации профермента и обеспечения каталитической активности. Конформационные различия определяют тип каталитической активности, которую способен выполнять гемоцианин. Гемоцианин также проявляет активность фенолоксидазы, но с замедленной кинетикой из-за большего стерического объема в активном центре. Частичная денатурация фактически улучшает активность фенолоксидазы гемоцианина, обеспечивая больший доступ к активному центру. Одна из таких моделей, включающая пару медных центров, соединенных пероксолигандом, показывает ν(O–O) при 741 см−1 и спектр UV-Vis с поглощениями при 349 и 551 нм. Оба этих измерения согласуются с экспериментальными наблюдениями для оксигемоцианина. Расстояние между атомами меди (Cu–Cu) в модельном комплексе составляет 3,56 Å, в оксигемоцианине – около 3,6 Å (в дезоксигемоцианине – около 4,6 Å).

Most hemocyanins bind with oxygen non cooperatively and are roughly one fourth as efficient as hemoglobin at transporting oxygen per amount of blood. Hemoglobin binds oxygen cooperatively due to steric conformation changes in the protein complex, which increases hemoglobin's affinity for oxygen when partially oxygenated. In some hemocyanins of horseshoe crabs and some other species of arthropods, cooperative binding is observed, with Hill coefficients of 1.6–3.0. Hill coefficients vary depending on species and laboratory measurement settings. Hemoglobin, for comparison, has a Hill coefficient of usually 2.8–3.0. In these cases of cooperative binding hemocyanin was arranged in protein sub complexes of 6 subunits (hexamer) each with one oxygen binding site; binding of oxygen on one unit in the complex would increase the affinity of the neighboring units. Each hexamer complex was arranged together to form a larger complex of dozens of hexamers. In one study, cooperative binding was found to be dependent on hexamers being arranged together in the larger complex, suggesting cooperative binding between hexamers. Hemocyanin oxygen binding profile is also affected by dissolved salt ion levels and pH. Hemocyanin is made of many individual subunit proteins, each of which contains two copper atoms and can bind one oxygen molecule (O2). Each subunit weighs about 75 kilodaltons (kDa). Subunits may be arranged in dimers or hexamers depending on species; the dimer or hexamer complex is likewise arranged in chains or clusters with weights exceeding 1500 kDa. The subunits are usually homogeneous, or heterogeneous with two variant subunit types. Because of the large size of hemocyanin, it is usually found free floating in the blood, unlike hemoglobin. Hexamers are characteristic of arthropod hemocyanins. A hemocyanin of the tarantula Eurypelma californicum is made up of 6 hexamers or 36 chains. Horseshoe crabs have an 8 hexamer (i. e. 48 chain) hemocyanin. Simple hexamers are found in the spiny lobster Panulirus interruptus and the isopod Bathynomus giganteus. In both cases inactive precursors to the enzymes (also called zymogens or proenzymes) must be activated first. This is done by removing the amino acid that blocks the entrance channel to the active site when the proenzyme is not active. There is currently no other known modifications necessary to activate the proenzyme and enable catalytic activity. Conformational differences determine the type of catalytic activity that the hemocyanin is able to perform. Hemocyanin also exhibits phenol oxidase activity, but with slowed kinetics from greater steric bulk at the active site. Partial denaturation actually improves hemocyanin's phenol oxidase activity by providing greater access to the active site. One such model, which features a pair of copper centers bridged side on by peroxo ligand, shows ν(O O) at 741 cm−1 and a UV Vis spectrum with absorbances at 349 and 551 nm. Both of these measurements agree with the experimental observations for oxyHc. The Cu Cu separation in the model complex is 3.56 Å, that of oxyhemocyanin is ca. 3.6 Å (deoxyHc: ca. 4.6 Å).

Противоопухолевые эффекты

Гемоцианин, содержащийся в крови чилийского абулона Concholepas concholepas, оказывает иммунотерапевтическое действие против рака мочевого пузыря в мышиных моделях. Мышей сенсибилизировали C. concholepas перед имплантацией клеток опухоли мочевого пузыря (MBT 2). У мышей, получавших гемоцианин C. concholepas, наблюдались противоопухолевые эффекты: увеличение продолжительности жизни, снижение роста и заболеваемости опухолями, отсутствие токсических эффектов, что указывает на потенциальное применение в будущей иммунотерапии поверхностного рака мочевого пузыря. Ключевой гемоцианин (KLH) – это иммуностимулятор, получаемый из циркулирующих гликопротеинов морского моллюска Megathura crenulata. Показано, что KLH эффективно подавляет пролиферацию раковых клеток молочной железы, поджелудочной железы и простаты в условиях in vitro. Гемоцианин из ключевого отверстия лимпета ингибирует рост рака пищевода Барретта у человека как посредством апоптотических, так и неапоптотических механизмов гибели клеток.

Кассовые исследования: воздействие на окружающую среду уровня гемоцианина

Исследование 2003 года, посвященное влиянию условий культивирования на метаболиты крови и гемоцианин белых креветок Litopenaeus vannamei, показало, что уровни гемоцианина, особенно оксигемоцианина, зависят от рациона. В исследовании сравнивались уровни оксигемоцианина в крови креветок, содержащихся в закрытом пруду на коммерческом корме, с уровнями у креветок, содержащихся в открытом пруду с более легкодоступным источником белка (живым кормом). У креветок, содержащихся в открытых прудах, уровни оксигемоцианина и глюкозы в крови были выше. Также было установлено, что уровни метаболитов крови, как правило, ниже у видов с низкой активностью, таких как крабы, лобстеры и креветки, содержащиеся в закрытом пруду, по сравнению с креветками, содержащимися в открытом пруду. Эта корреляция, вероятно, указывает на морфологическую и физиологическую эволюцию ракообразных. Уровни этих белков и метаболитов крови, по-видимому, определяются энергетическими потребностями и доступностью источников энергии.