Введение
Научная дисциплина
Химическая биология – это научная дисциплина, находящаяся на стыке химии и биологии. Эта дисциплина включает в себя применение химических методов, анализа и, часто, небольших молекул, полученных посредством синтетической химии, для изучения и манипулирования биологическими системами. Хотя химическую биологию часто путают с биохимией, которая изучает химию биомолекул и регуляцию биохимических путей внутри и между клетками, химическая биология остается отличной областью, фокусируясь на использовании химических инструментов для решения биологических задач. Термин "химическая биология" используется с начала XX века и имеет корни в научных открытиях начала XIX века. Впервые этот термин встречается в книге Алонзо Э. Тейлора 1907 года под названием «О ферментации», а затем был использован в статье Джона Б. Лита 1930 года под названием «Харвеевская речь о рождении химической биологии». Однако, неясно, когда именно этот термин был впервые употреблен. Работы показали, что биологические соединения могут быть синтезированы из неорганических исходных материалов, что ослабило прежнее представление о витализме, то есть о необходимости «живого» источника для производства органических соединений. Работы Вёлера часто рассматриваются как важный вклад в развитие органической химии и синтеза природных соединений, оба из которых играют значительную роль в современной химической биологии. Исследования Фридриха Мишера в конце XIX века, посвященные изучению клеточного содержимого лейкоцитов человека, привели к открытию «нуклеина», который впоследствии был переименован в ДНК. Эта работа заложила основу для открытия Уотсоном и Криком двойной спиральной структуры ДНК. Возрастающий интерес к химической биологии привел к созданию ряда журналов, посвященных этой области. Nature Chemical Biology, основанный в 2005 году, и ACS Chemical Biology, основанный в 2006 году, являются двумя наиболее известными журналами в этой области, с импакт-факторами 14,8 и 4,0 соответственно.
Комбинационная химия
Комбинаторная химия подразумевает одновременный синтез большого числа родственных соединений для высокопроизводительного анализа. Химики-биологи могут применять принципы комбинаторной химии для синтеза активных лекарственных веществ и повышения эффективности скрининга. Подобным образом эти принципы могут быть использованы в областях сельского хозяйства и пищевых исследований, в частности, при синтезе неестественных соединений и создании новых ингибиторов ферментов.
Синтез пептидов
Химический синтез белков является ценным инструментом в химической биологии, поскольку позволяет вводить неестественные аминокислоты, а также осуществлять специфическое включение остатков "посттрансляционных модификаций", таких как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование и даже убиквитинирование. Эти свойства важны для химических биологов, так как неестественные аминокислоты можно использовать для изучения и изменения функциональности белков, а посттрансляционные модификации широко известны своей способностью регулировать структуру и активность белков. Хотя для достижения этих целей разработаны и чисто биологические методы, химический синтез пептидов зачастую требует меньше технических усилий и практических затрат для получения небольших количеств целевого белка. Для получения полипептидных цепей, сопоставимых по размеру с белками, из небольших пептидных фрагментов, полученных синтетическим путем, химические биологи могут использовать процесс нативной химической лигации. Нативная химическая лигация заключается в соединении C-терминального тиоэстера и N-терминального цистеинового остатка, что в конечном итоге приводит к образованию "нативной" амидной связи. Среди других стратегий, используемых для лигации пептидных фрагментов с применением химии ацильного переноса, впервые представленной в нативной химической лигации, – лигация экспрессированных белков, методы сульфурирования/десульфурирования и использование удаляемых тиольных вспомогательных групп.
Методы обогащения для протеомики
Химические биологи работают над улучшением протеомики, разрабатывая стратегии обогащения, химические аффинные метки и новые зонды. Образцы для протеомического анализа часто содержат множество пептидных последовательностей, и последовательность, представляющая интерес, может быть представлена в большом количестве или встречаться в низкой концентрации, что затрудняет ее обнаружение. Методы химической биологии позволяют снизить сложность образца посредством селективного обогащения с использованием аффинной хроматографии. Это предполагает нацеливание на пептид, обладающий отличительной характеристикой, такой как метка биотина или посттрансляционное модифицирование. Разработаны методы, включающие использование антител, лектинов для захвата гликопротеинов, иммобилизованных ионов металлов для захвата фосфорилированных пептидов и ферментных субстратов для захвата определенных ферментов.
Энзимные зонды
Для исследования ферментативной активности, в отличие от общего содержания белка, были разработаны реагенты, основанные на активности, для маркировки ферментативно активной формы белков (см. Протеомика на основе активности). Например, ингибиторы серингидролаз и цистеинпротеаз были превращены в ингибиторы-самоубийцы. Эта стратегия повышает возможность селективного анализа компонентов низкой концентрации благодаря прямому воздействию на них. Ферментативную активность также можно отслеживать по преобразованному субстрату. Идентификация ферментных субстратов является сложной задачей в протеомике и имеет решающее значение для понимания путей передачи сигналов в клетках. Был разработан метод, использующий "аналогочувствительные" киназы для маркировки субстратов с помощью неестественного аналога АТФ, что облегчает визуализацию и идентификацию благодаря уникальному метке.
Используя биологию
Многие исследовательские программы также сосредоточены на использовании природных биомолекул для выполнения биологических задач или поддержки новых химических методов. В связи с этим исследователи в области химической биологии показали, что ДНК может служить матрицей для синтетической химии, самособирающиеся белки – структурным каркасом для новых материалов, а РНК может быть эволюционирована in vitro для создания новых каталитических функций. Кроме того, гетеробифункциональные (двусторонние) синтетические малые молекулы, такие как димеризаторы или PROTAC, объединяют два белка внутри клеток, что позволяет синтетически индуцировать важные новые биологические функции, например, направленное разрушение белков.
Направленная эволюция
Основной целью белковой инженерии является разработка новых пептидов или белков с заданной структурой и химической активностью. Поскольку наши знания о взаимосвязи между первичной последовательностью, структурой и функцией белков ограничены, рациональное конструирование новых белков с заданными свойствами представляется крайне сложной задачей. В направленной эволюции повторяющиеся циклы генетического разнообразия, за которыми следует процесс скрининга или селекции, используются для имитации естественного отбора в лабораторных условиях с целью создания новых белков с желаемой активностью. Существует несколько методов создания больших библиотек вариантов последовательностей. Среди наиболее распространенных – воздействие на ДНК ультрафиолетовым излучением или химическими мутагенами, ПЦР с ошибками, использование вырожденных кодонов или рекомбинации. После создания большой библиотеки вариантов применяются методы селекции или скрининга для выявления мутантов с нужными характеристиками. К распространенным методам селекции/скрининга относятся проточная цитометрия (FACS), дисплей мРНК, дисплей фагов и in vitro компартментализация. Как только полезные варианты обнаружены, их последовательность ДНК амплифицируется и подвергается дальнейшим раундам разнообразия и селекции. Разработка методов направленной эволюции была отмечена в 2018 году присуждением Нобелевской премии по химии Франсис Арнольд за эволюцию ферментов, а также Джорджу Смиту и Грегори Винтеру за дисплей фагов.
Биоортогональные реакции
Успешная маркировка молекулы, представляющей интерес, требует специфической функционализации этой молекулы для химически специфического взаимодействия с оптическим зондом. Чтобы эксперимент по маркировке считался надежным, эта функционализация должна минимально возмущать систему. К сожалению, эти требования часто трудно выполнить. Многие реакции, обычно доступные органическим химикам в лаборатории, недоступны в живых системах. Реакции, чувствительные к воде и окислительно-восстановительному потенциалу, не будут протекать, реагенты, склонные к нуклеофильной атаке, не обеспечат химической специфичности, а любые реакции с высокими кинетическими барьерами не найдут достаточной энергии в относительно прохладной среде живой клетки. Таким образом, химики недавно разработали ряд методов биоортогональной химии, которые протекают химически специфично, несмотря на присутствие множества реакционноспособных веществ in vivo. Соединение зонда с молекулой, представляющей интерес, должно происходить в разумные сроки, поэтому кинетика реакции соединения должна быть достаточно высокой. Химия «клик» хорошо подходит для решения этой задачи, поскольку «кликовые» реакции быстрые, спонтанные, селективные и дают высокий выход продукта. К сожалению, самая известная «кликовая» реакция – [3+2] циклоприсоединение между азидом и ациклическим алкином – катализируется медью, что создает серьезную проблему для применения in vivo из-за токсичности меди. Чтобы избежать необходимости в катализаторе, лаборатория Кэролин Р. Бертоцци внедрила внутреннее напряжение в алкиновые соединения, используя циклический алкин. В частности, циклооктин реагирует с азидосодержащими молекулами с заметной энергией.
Открытие биомолекул с помощью метагеномики
Достижения в современных технологиях секвенирования в конце 1990-х годов позволили ученым исследовать ДНК сообществ организмов в их естественной среде ("eDNA"), без культивирования отдельных видов в лаборатории. Этот метагеномный подход дал возможность изучить широкий спектр организмов, которые ранее не были охарактеризованы, в том числе из-за невозможности подобрать подходящие условия для их роста. Источники eDNA включают почвы, океан, подземные воды, горячие источники, гидротермальные источники, полярные ледяные шапки, гиперсоленые среды обитания и среды с экстремальными значениями pH. Среди множества применений метагеномики исследователи, такие как Джо Хандельсман, Джон Кларди и Роберт М. Гудман, изучали метагеномные подходы для поиска биологически активных молекул, таких как антибиотики. Для идентификации генов, кодирующих небольшие биоактивные молекулы, используются стратегии функционального или гомологического скрининга. Функциональные метагеномные исследования направлены на поиск специфических фенотипов, связанных с молекулами, обладающими определенными характеристиками. Гомологические метагеномные исследования, напротив, предназначены для изучения генов с целью выявления консервативных последовательностей, ранее ассоциированных с экспрессией биологически активных молекул. Функциональные метагеномные исследования позволяют открывать новые гены, кодирующие биологически активные молекулы. Эти методы включают анализы на агаровом слое, где антибиотики создают зоны подавления роста тестовых микроорганизмов, и pH-анализы, позволяющие выявлять изменения pH, вызванные вновь синтезированными молекулами, с использованием pH-индикатора на агарной пластинке. Скрининг экспрессии генов, индуцированный субстратом (SIGEX), – метод скрининга экспрессии генов, индуцированных химическими соединениями, – также используется для поиска генов с определенными функциями. Кроме того, in silico анализ данных Глобального океанического метагеномного обследования выявил 20 новых лантибиотических циклаз.
Киназы
Посттрансляционная модификация белков фосфатными группами посредством киназ является ключевым регуляторным этапом во всех биологических системах. События фосфорилирования, осуществляемые протеинкиназами, или дефосфорилирования, осуществляемые фосфатазами, приводят к активации или деактивации белков. Эти события влияют на регуляцию физиологических путей, что делает возможность их анализа и изучения неотъемлемой частью понимания деталей клеточных процессов. Существует ряд проблем, в частности, огромный размер фосфопротеома, преходящий характер событий фосфорилирования и связанные с этим физические ограничения классических биологических и биохимических методов, которые препятствовали прогрессу в этой области. Благодаря использованию малых молекул, модулирующих активность протеинкиназ, химические биологи получили более глубокое понимание эффектов фосфорилирования белков. Например, неселективные и селективные ингибиторы киназ, такие как класс соединений пиридинилимидазола, являются мощными ингибиторами, полезными для анализа сигнальных путей MAP-киназ. Эти соединения пиридинилимидазола действуют, нацеливаясь на АТФ-связывающий карман. Хотя этот подход, а также связанные с ним подходы с незначительными модификациями, оказались эффективными в ряде случаев, эти соединения не обладают достаточной специфичностью для более широкого применения. Другой класс соединений, ингибиторы, основанные на механизме действия, объединяют знания об энзимологии киназ с ранее использованными мотивами ингибирования. Например, "бисубстратный аналог" ингибирует активность киназы, связываясь как с консервативным АТФ-связывающим карманом, так и с участком распознавания белка/пептида на конкретной киназе. Исследовательские группы также использовали аналоги АТФ в качестве химических зондов для изучения киназ и идентификации их субстратов. Разработка новых химических методов включения фосфомиметических аминокислот в белки предоставила важные сведения о влиянии событий фосфорилирования. События фосфорилирования обычно изучались путем мутации идентифицированного сайта фосфорилирования (серина, треонина или тирозина) в аминокислоту, такую как аланин, которая не может быть фосфорилирована. Однако эти методы имеют ограничения, и химические биологи разработали усовершенствованные способы исследования фосфорилирования белков. Встраивая фосфосерин, фосфотреонин или аналогичные фосфонатные имитаты в нативные белки, исследователи могут проводить исследования in vivo для изучения эффектов фосфорилирования, увеличивая продолжительность события фосфорилирования и минимизируя часто неблагоприятные последствия мутаций. Экспрессированная лигация белков оказалась успешной техникой для синтетического производства белков, содержащих фосфомиметические молекулы на любом конце. Кроме того, исследователи использовали мутагенез с использованием неестественных аминокислот в целевых участках внутри пептидной последовательности. Достижения в области химической биологии также улучшили классические методы визуализации активности киназ. Например, разработка пептидных биосенсоров – пептидов, содержащих включенные флюорофоры, – улучшила временное разрешение in vitro анализов связывания. Одним из наиболее полезных методов изучения активности киназ является флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET). Для использования FRET в исследованиях фосфорилирования флуоресцентные белки соединяются как с доменом связывания фосфоаминокислоты, так и с пептидом, который может быть фосфорилирован. При фосфорилировании или дефосфорилировании пептидного субстрата происходит конформационное изменение, приводящее к изменению флуоресценции. FRET также использовался в сочетании с микроскопией изображения времени жизни флуоресценции (FLIM) или флуоресцентно-конъюгированными антителами и проточной цитометрией для получения количественных результатов с отличным временным и пространственным разрешением.
Биологическая флуоресценция
Химические биологи часто изучают функции биологических макромолекул, используя методы флуоресценции. Преимущество флуоресценции перед другими методами заключается в ее высокой чувствительности, неинвазивности, безопасном детектировании и способности модулировать сигнал флуоресценции. В последние годы открытие Роджером Й. Цьеном и другими зеленого флуоресцентного белка (GFP), гибридных систем и квантовых точек позволило более точно оценивать локализацию и функцию белка. Используются три основных типа флюорофоров: малые органические красители, зеленые флуоресцентные белки и квантовые точки. Малые органические красители обычно имеют массу менее 1 кДа и были модифицированы для повышения фотостабильности и яркости, а также для снижения самогашения. Квантовые точки характеризуются очень узкой шириной спектра, высокой молярной поглощающей способностью и квантовым выходом. Как органические, так и квантовые красители не способны распознавать белок-мишень без помощи антител, поэтому требуется иммуномаркировка. Флуоресцентные белки генетически кодируются и могут быть слиты с интересующим белком. Другой метод генетической метки – тетрацистеиновая биарсеническая система, требующая модификации целевой последовательности, включающей четыре цистеина, которые связывают мембранно-проницаемые биарсениковые молекулы, зеленые и красные красители "FlAsH" и "ReAsH" с пикомолярным сродством. Как флуоресцентные белки, так и биарсенический тетрацистеин могут быть экспрессированы в живых клетках, но имеют существенные ограничения при эктопической экспрессии и могут вызывать потерю функции. Методы флуоресценции использовались для оценки различных динамических процессов белка, включая отслеживание белка, конформационные изменения, белок-белковые взаимодействия, синтез и обновление белка, а также активность ферментов и другие. Три основных подхода для измерения чистого перераспределения и диффузии белка – это отслеживание отдельных частиц, корреляционная спектроскопия и методы фотомаркировки. При отслеживании отдельных частиц отдельная молекула должна быть достаточно яркой и редкой, чтобы ее можно было отслеживать от одного видеокадра к другому. Корреляционная спектроскопия анализирует флуктуации интенсивности, возникающие в результате миграции флуоресцентных объектов в небольшой объем и из него в фокусе лазера. При фотомаркировке флуоресцентный белок может быть дегаширован в субклеточной области с использованием интенсивного локального освещения, а судьба помеченной молекулы может быть визуализирована непосредственно. Мишале и его коллеги использовали квантовые точки для отслеживания отдельных частиц, используя биотин-конъюгированные квантовые точки в клетках HeLa. Одним из лучших способов обнаружения конформационных изменений в белках является маркировка белка-мишени двумя флюорофорами, расположенными в непосредственной близости друг от друга. FRET будет реагировать на внутренние конформационные изменения, возникающие в результате переориентации одного флюорофора относительно другого. Также можно использовать флуоресценцию для визуализации активности фермента, как правило, с помощью протеомики на основе гашеной активности (qABP). Ковалентное связывание qABP с активным центром целевого фермента предоставит прямые доказательства того, что фермент ответственен за сигнал при высвобождении гасителя и восстановлении флуоресценции.
Бакалавриат
Несмотря на рост биологических исследований в рамках химических факультетов, попыток интеграции химической биологии в учебные планы бакалавриата недостаточно. Например, хотя Американское химическое общество (ACS) требует включения биохимии в обязательные курсы при получении степени бакалавра химии, никаких других курсов по химии, связанных с биологией, не предусмотрено. Несмотря на то, что курс химической биологии часто не является обязательным для получения степени бакалавра химии, многие университеты сейчас предлагают вводные курсы по химической биологии для студентов бакалавриата. Так, в Университете Британской Колумбии предлагается курс по синтетической химической биологии для студентов четвертого курса.