Генетическая инженерия в производстве фармацевтических препаратов.

Введение

Генетическая инженерия для производства фармацевтических препаратов

Фарминг, образованное путем слияния слов "farming" (фермерское хозяйство) и "pharmaceutical" (фармацевтический препарат), относится к использованию генетической инженерии для встраивания генов, кодирующих полезные фармацевтические препараты, в организмы животных или растений-хозяев, которые обычно не экспрессируют эти гены, тем самым создавая генетически модифицированный организм (ГМО). Фарминг также известен как молекулярное земледелие, молекулярный фарминг или биофармация. Продуктами фарминга являются рекомбинантные белки или продукты их метаболизма. Рекомбинантные белки чаще всего производятся с использованием бактерий или дрожжей в биореакторе, однако фарминг предоставляет производителю преимущество в виде отсутствия необходимости в дорогостоящей инфраструктуре, а также возможности быстрого увеличения производственных мощностей для удовлетворения спроса со значительным снижением затрат.

История

Первым рекомбинантным растительным белком (РРБ) был альбумин человеческой сыворотки, впервые полученный в 1990 году в трансгенных растениях табака и картофеля. Испытания выращивания этих культур в открытом грунте начались в Соединенных Штатах в 1992 году и проводятся ежегодно с тех пор. Хотя Министерство сельского хозяйства США одобрило посадку фармацевтических культур в каждом штате, большинство испытаний проводилось на Гавайях, в Небраске, Айове и Висконсине. В начале 2000-х годов индустрия производства фармацевтических белков в растениях (фарминг) была развитой. Была доказана возможность производства многих терапевтических белков, включая антитела, препараты крови, цитокины, факторы роста, гормоны, рекомбинантные ферменты, а также вакцины для человека и ветеринарные вакцины. К 2003 году около 200 биотехнологических компаний разрабатывали несколько продуктов РРБ для лечения заболеваний человека, в том числе рекомбинантную желудочную липазу для лечения кистозного фиброза и антитела для профилактики кариеса и лечения лимфомы Ходжкина. Однако в конце 2002 года, когда компания ProdiGene наращивала производство трипсина для коммерческого запуска, было обнаружено, что самосевы (оставшиеся после предыдущего урожая) одного из их генетически модифицированных сортов кукурузы были собраны вместе с обычной соей, посаженной на этом поле позднее. Компания ProdiGene была оштрафована на 250 000 долларов и получила предписание от Министерства сельского хозяйства США выплатить более 3 миллионов долларов на покрытие расходов по очистке. Это вызвало широкий резонанс и серьезно замедлило развитие фарминга. В 2005 году Anheuser Busch пригрозила бойкотом риса, выращенного в Миссури, из-за планов Ventria Bioscience выращивать фарм-рис в этом штате. Был достигнут компромисс, но Ventria отозвала разрешение на посадку в Миссури по не связанным с этим причинам. Индустрия медленно восстанавливается, сосредоточившись на фарминге в простых растениях, выращиваемых в биореакторах, и на выращивании генетически модифицированных культур в теплицах. Некоторые компании и научные группы продолжают проводить полевые испытания генетически модифицированных культур, производящих лекарственные препараты. В 2006 году Dow AgroSciences получила одобрение Министерства сельского хозяйства США на продажу вакцины для птицы против болезни Ньюкасла, произведенной в культуре растительных клеток – первой вакцины, произведенной в растениях, одобренной в США.

The first recombinant plant derived protein (PDP) was human serum albumin, initially produced in 1990 in transgenic tobacco and potato plants. Open field growing trials of these crops began in the United States in 1992 and have taken place every year since. While the United States Department of Agriculture has approved planting of pharma crops in every state, most testing has taken place in Hawaii, Nebraska, Iowa, and Wisconsin. In the early 2000s, the pharming industry was robust. Proof of concept has been established for the production of many therapeutic proteins, including antibodies, blood products, cytokines, growth factors, hormones, recombinant enzymes and human and veterinary vaccines. By 2003 several PDP products for the treatment of human diseases were under development by nearly 200 biotech companies, including recombinant gastric lipase for the treatment of cystic fibrosis, and antibodies for the prevention of dental caries and the treatment of non Hodgkin's lymphoma. However, in late 2002, just as ProdiGene was ramping up production of trypsin for commercial launch it was discovered that volunteer plants (left over from the prior harvest) of one of their GM corn products were harvested with the conventional soybean crop later planted in that field. Unreliable source: date=March 2013 ProdiGene was fined $250,000 and ordered by the USDA to pay over $3 million in cleanup costs. This raised a furor and set the pharming field back, dramatically. In 2005, Anheuser Busch threatened to boycott rice grown in Missouri because of plans by Ventria Bioscience to grow pharm rice in the state. A compromise was reached, but Ventria withdrew its permit to plant in Missouri due to unrelated circumstances. The industry has slowly recovered, by focusing on pharming in simple plants grown in bioreactors and on growing GM crops in greenhouses. Some companies and academic groups have continued with open field trials of GM crops that produce drugs. In 2006 Dow AgroSciences received USDA approval to market a vaccine for poultry against Newcastle disease, produced in plant cell culture – the first plant produced vaccine approved in the U. S.

Историческое развитие

В настоящее время молоко является наиболее отработанной системой для производства рекомбинантных белков из трансгенных организмов. Кровь, яичный белок, семенная плазма и моча – другие теоретически возможные системы, но все они имеют недостатки. Например, по состоянию на 2012 год кровь не способна поддерживать высокие уровни стабильных рекомбинантных белков, а биологически активные белки в крови могут негативно повлиять на здоровье животных. Экспрессия в молоке млекопитающих, таких как коровы, овцы или козы, является распространенным применением, поскольку производство молока обильно, а очистка из молока относительно проста. Хомяки и кролики также использовались в предварительных исследованиях благодаря их более быстрому размножению. Один из подходов к этой технологии – создание трансгенного млекопитающего, способного производить биофармацевтический препарат в своем молоке (или крови, или моче). После получения животного, как правило, с использованием метода пронуклеарной микроинъекции, становится целесообразным использование технологии клонирования для создания дополнительного потомства, несущего благоприятный модифицированный геном. В феврале 2009 года FDA США выдало разрешение на маркетинг первого препарата, произведенного на генетически модифицированном скоте. Этот препарат называется ATryn – антитромбин, очищенный из молока генетически модифицированных коз. Разрешение на реализацию было выдано Европейским агентством лекарственных средств в августе 2006 года.

Вопросы патентоспособности

Как указано выше, некоторые млекопитающие, обычно используемые для производства продуктов питания (такие как козы, овцы, свиньи и коровы), были модифицированы для производства непищевых продуктов, практика, иногда называемая фармингом. Использование генетически модифицированных коз было одобрено FDA и EMA для производства ATryn, то есть рекомбинантного антитромбина, антикоагулянтного белкового препарата. Эти продукты, "производимые путем превращения животных в "машины" для производства лекарств посредством генетической модификации", иногда называют биофармацевтическими препаратами. Патентоспособность таких биофармацевтических препаратов и их процесса производства остается неопределенной. Вероятно, сами биофармацевтические препараты, полученные таким образом, не патентоспособны, при условии, что они химически идентичны существующим препаратам, которые они имитируют. Ряд решений Верховного суда США XIX века устанавливают, что ранее известный природный продукт, произведенный искусственным путем, не может быть запатентован. Однако можно привести аргумент в пользу патентоспособности процесса производства биофармацевтических препаратов, поскольку генетическая модификация животных для производства лекарственного средства отличается от предыдущих методов производства; более того, одно решение Верховного суда, по-видимому, оставляет такую возможность открытой. С другой стороны, высказывается мнение, что недавнее решение Верховного суда по делу Mayo v. Prometheus может создать проблему, поскольку, в соответствии с этим решением, "можно утверждать, что те или иные гены производят этот белок тем же способом, что и всегда у млекопитающих, производя тот же продукт, а используемая технология генетической модификации является общепринятой, так что этапы процесса "не добавляют ничего к законам природы, чего там уже нет". Если этот аргумент возобладает в суде, процесс также не будет подлежать патентной защите. Этот вопрос пока не был решен в судебном порядке.

В растениях

Фармацевтические препараты, полученные из растений (PMP), также известные как фарминг, являются подсектором биотехнологической отрасли, включающим в себя процесс генетической инженерии растений для производства определенных типов терапевтически важных белков и связанных с ними молекул, таких как пептиды и вторичные метаболиты. Затем эти белки и молекулы могут быть собраны и использованы для производства фармацевтических препаратов. Arabidopsis часто используется в качестве модельного организма для изучения экспрессии генов у растений, в то время как фактическое производство может осуществляться в кукурузе, рисе, картофеле, табаке, льне или шафране. Табак является популярным выбором организма для экспрессии трансгенов, поскольку он легко трансформируется, производит большое количество ткани и хорошо растет in vitro и в теплицах. Преимущество риса и льна заключается в их самоопылении, что позволяет избежать проблем, связанных с распространением генов (см. ниже). Однако человеческая ошибка все же может привести к попаданию модифицированных культур в пищевые продукты. Использование второстепенных культур, таких как шафран или табак, позволяет избежать значительного политического давления и риска для продовольственной безопасности, связанных с использованием основных культур, таких как бобы или рис. Экспрессия белков в растительных клетках или культурах волосатых корней также минимизирует риск переноса генов, но при более высокой стоимости производства. Стерильные гибриды также могут использоваться для биоконфаймента трансгенных растений, хотя стабильные линии установить не удается. Зерновые культуры иногда выбирают для фарминга, поскольку белковые продукты, направляемые в эндосперм злаков, обладают высокой термостабильностью. Эта характеристика делает их привлекательной целью для производства съедобных вакцин, поскольку белки вирусной оболочки, хранящиеся в зернах, не требуют хранения в холодильнике, как это необходимо для многих существующих вакцин. Поддержание цепи поставок вакцин с контролируемой температурой часто затруднено при доставке вакцин в развивающиеся страны. Чаще всего трансформация растений осуществляется с использованием Agrobacterium tumefaciens. Ген, кодирующий интересующий белок, часто экспрессируется под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S) – мощного конститутивного промотора, обеспечивающего экспрессию в растениях. К интересующему белку могут быть присоединены сигналы локализации, чтобы вызвать его накопление в определенном субклеточном компартменте, таком как хлоропласты или вакуоли. Это делается для повышения урожайности, упрощения очистки или обеспечения правильной укладки белка. Недавно было показано, что включение антисмысловых генов в экспрессионные кассеты может улучшить процесс фарминга растений. Исследователи из Японии трансформировали рис антисмысловым геном SPK, который нарушает накопление крахмала в рисовых зернах, чтобы продукты накапливались в водянистом соке, который легче очищать. В последнее время некоторые некультивируемые растения, такие как ряска Lemna minor или мох Physcomitrella patens, оказались полезными для производства биофармацевтических препаратов. Эти неприхотливые организмы можно выращивать в биореакторах (в отличие от выращивания в поле), секретировать трансформированные белки в питательную среду и, таким образом, значительно снизить затраты на очистку белка при подготовке рекомбинантных белков для медицинского применения. Кроме того, оба вида могут быть модифицированы для секреции белков с паттернами гликозилирования, характерными для человека, что является улучшением по сравнению с традиционными системами экспрессии генов растений. Biolex Therapeutics разработала платформу экспрессии на основе ряски; она продала бизнес компании Synthon и обанкротилась в 2012 году. Кроме того, израильская компания Protalix разработала метод производства терапевтических препаратов в культивируемых трансгенных клетках моркови или табака. Protalix и ее партнер, Pfizer, получили одобрение FDA на продажу своего препарата талиглюцеразы альфа (Elelyso) для лечения болезни Гоше в 2012 году.

Plant made pharmaceuticals (PMPs), also referred to as pharming, is a sub sector of the biotechnology industry that involves the process of genetically engineering plants so that they can produce certain types of therapeutically important proteins and associated molecules such as peptides and secondary metabolites. The proteins and molecules can then be harvested and used to produce pharmaceuticals. Arabidopsis is often used as a model organism to study gene expression in plants, while actual production may be carried out in maize, rice, potatoes, tobacco, flax or safflower. Tobacco has been a highly popular choice of organism for the expression of transgenes, as it is easily transformed, produces abundant tissues, and survives well in vitro and in greenhouses. The advantage of rice and flax is that they are self pollinating, and thus gene flow issues (see below) are avoided. However, human error could still result in modified crops entering the food supply. Using a minor crop such as safflower or tobacco avoids the greater political pressures and risk to the food supply involved with using staple crops such as beans or rice. Expression of proteins in plant cell or hairy root cultures also minimizes risk of gene transfer, but at a higher cost of production. Sterile hybrids may also be used for the bioconfinement of transgenic plants, although stable lines cannot be established. Grain crops are sometimes chosen for pharming because protein products targeted to the endosperm of cereals have been shown to have high heat stability. This characteristic makes them an appealing target for the production of edible vaccines, as viral coat proteins stored in grains do not require cold storage the way many vaccines currently do. Maintaining a temperature controlled supply chain of vaccines is often difficult when delivering vaccines to developing countries. Most commonly, plant transformation is carried out using Agrobacterium tumefaciens. The protein of interest is often expressed under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), a powerful constitutive promoter for driving expression in plants. Localization signals may be attached to the protein of interest to cause accumulation to occur in a specific sub cellular location, such as chloroplasts or vacuoles. This is done in order to improve yields, simplify purification, or so that the protein folds properly. Recently, the inclusion of antisense genes in expression cassettes has been shown to have potential for improving the plant pharming process. Researchers in Japan transformed rice with an antisense SPK gene, which disrupts starch accumulation in rice seeds, so that products would accumulate in a watery sap that is easier to purify. Recently, several non crop plants such as the duckweed Lemna minor or the moss Physcomitrella patens have shown to be useful for the production of biopharmaceuticals. These frugal organisms can be cultivated in bioreactors (as opposed to being grown in fields), secrete the transformed proteins into the growth medium and, thus, substantially reduce the burden of protein purification in preparing recombinant proteins for medical use. In addition, both species can be engineered to cause secretion of proteins with human patterns of glycosylation, an improvement over conventional plant gene expression systems. Biolex Therapeutics developed a duckweed based expression platform; it sold the business to Synthon and declared bankruptcy in 2012. Additionally, an Israeli company, Protalix, has developed a method to produce therapeutics in cultured transgenic carrot or tobacco cells. Protalix and its partner, Pfizer, received FDA approval to market its drug, taliglucerase alfa (Elelyso), as a treatment for Gaucher's disease, in 2012.

Регулирование

Регулирование генной инженерии охватывает подходы, применяемые правительствами для оценки и управления рисками, связанными с разработкой и выпуском генетически модифицированных культур. Существуют различия в регулировании ГМ-культур – включая те, которые используются для производства фармацевтических веществ – между странами, причём наиболее значительные различия наблюдаются между США и Европой. Регулирование в каждой стране варьируется в зависимости от предполагаемого назначения продуктов генной инженерии. Например, культура, не предназначенная для использования в пищу, как правило, не рассматривается органами, отвечающими за безопасность пищевых продуктов.

Противоречия

Вокруг ГМО существуют споры на нескольких уровнях, включая этичность их создания, вопросы интеллектуальной собственности и рыночной конъюнктуры, воздействие ГМ-культур на окружающую среду и роль ГМ-культур в промышленном сельском хозяйстве в целом. Также существуют отдельные споры, касающиеся производства фармацевтических растений (фарминга).

Преимущества

Растения не содержат патогенов, которые могли бы быть опасны для здоровья человека. Кроме того, на уровне фармакологически активных белков в растениях отсутствуют белки, сходные с человеческими. С другой стороны, растения достаточно близки к животным и человеку, чтобы правильно обрабатывать и модифицировать как животные, так и человеческие белки. Их семена и плоды также предоставляют стерильную упаковку для ценных лекарственных препаратов и обеспечивают определенный срок годности. Глобальный спрос на фармацевтические препараты достиг беспрецедентного уровня. Расширение существующих микробных систем, хотя и возможно для некоторых терапевтических продуктов, не является удовлетворительным решением по ряду причин.

Недостатки

Хотя молекулярное земледелие является одним из применений генной инженерии, существуют опасения, которые специфичны именно для него. В случае с генетически модифицированными (ГМ) продуктами питания, основное беспокойство связано с безопасностью этих продуктов для употребления в пищу. В ответ на это утверждается, что гены, улучшающие характеристики урожая, такие как засухоустойчивость или устойчивость к пестицидам, не оказывают влияния на сам продукт питания. Считается также, что другие ГМ-продукты, находящиеся в разработке, например, фрукты, предназначенные для более быстрого созревания или увеличения размера, не отличаются по воздействию на человека от не-ГМ сортов. В отличие от этого, молекулярное земледелие не предполагает выращивание культур для пищевой цепи. Оно производит растения, содержащие физиологически активные соединения, накапливающиеся в тканях растений. Поэтому особое внимание уделяется необходимости сдержанности и осторожности для защиты здоровья потребителей и биоразнообразия окружающей среды.