Введение

биотехнологический метод

Производство белка – это биотехнологический процесс получения определенного белка. Как правило, это достигается путем манипулирования экспрессией генов в организме, чтобы он производил большое количество рекомбинантного гена. Этот процесс включает транскрипцию рекомбинантной ДНК в матричную РНК (мРНК), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в функциональные белки и могут направляться в определенные субклеточные или внеклеточные локализации. Системы производства белка (также известные как системы экспрессии) используются в биологических науках, биотехнологии и медицине. Исследования в области молекулярной биологии используют множество белков и ферментов, многие из которых получают с помощью систем экспрессии; в частности, ДНК-полимеразу для ПЦР, обратную транскриптазу для анализа РНК, рестрикционные эндонуклеазы для клонирования, а также для создания белков, которые используются при разработке лекарств в качестве биологических мишеней или в качестве потенциальных лекарственных средств. Системы экспрессии также широко применяются в промышленном ферментировании, особенно в производстве биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин для лечения диабета, и для производства ферментов.

Системы производства белка

Обычно используемые системы для производства белков включают системы, основанные на бактериях, дрожжах, бакуловирусах/насекомых, клетках млекопитающих, а в последнее время – на нитевидных грибах, таких как Myceliophthora thermophila. При производстве биофармацевтических препаратов с использованием одной из этих систем, в конечный продукт в следовых количествах также попадают примеси, связанные с процессом, известные как белки клеток-хозяев.

Системы на основе клеток

Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как "сочетание экспрессионного вектора, клонированной в него ДНК и клетки-хозяина, обеспечивающего условия для реализации функции чужеродного гена и, следовательно, для производства белка на высоком уровне". Сверхэкспрессия – это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии гена, приводящий к ярко выраженному фенотипу, связанному с этим геном. Существует множество способов введения чужеродной ДНК в клетку для экспрессии, и для этих целей могут использоваться различные клетки-хозяева – каждая система экспрессии имеет свои преимущества и недостатки. Системы экспрессии обычно идентифицируют по клетке-хозяину, источнику ДНК или механизму доставки генетического материала. Например, к распространенным хозяевам относятся бактерии (такие как E. coli, B. subtilis) и дрожжи (такие как S. cerevisiae).

Corynebacterium

Непатогенные виды грамположительных Corynebacterium используются для коммерческого производства различных аминокислот. Вид C. glutamicum широко применяется для производства глутамата и лизина, которые являются компонентами продуктов питания для человека, кормов для животных и фармацевтических препаратов. В C. glutamicum осуществлена экспрессия функционально активного человеческого эпидермального фактора роста, что демонстрирует потенциал для промышленного производства человеческих белков. Экспрессируемые белки могут быть направлены на секрецию либо по общему секреторному пути (Sec), либо по пути двойной транслокации аргинина (Tat). В отличие от грамотрицательных бактерий, грамположительные Corynebacterium лишены липополисахаридов, выполняющих функцию антигенных эндотоксинов для человека.

Pseudomonas fluorescens (флуоресцентная псевдомона)

Непатогенные и грам-отрицательные бактерии Pseudomonas fluorescens используются для высокоуровневого производства рекомбинантных белков, как правило, для разработки биотерапевтических средств и вакцин. P. fluorescens – это метаболически универсальный организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и ускоренную разработку сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и эффективно производить высокие титры активного, растворимого белка.

Дрожжи

Системы экспрессии, использующие S. cerevisiae или Pichia pastoris, обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков, которые подвергаются обработке, схожей с таковой в клетках млекопитающих, с высокой продуктивностью и в химически определенных средах. (Штаммы Sf9, Sf21, High Five) или клетки млекопитающих (HeLa, HEK 293) позволяют получать гликозилированные или мембранные белки, которые невозможно произвести в грибковых или бактериальных системах.