Клик-химия: точное соединение молекул для биологических исследований

Введение

Реакции малых молекул, позволяющие соединять выбранные субстраты с конкретными биомолекулами.

В химическом синтезе, клик-химия – это класс простых, атом-экономичных реакций, обычно используемых для соединения двух выбранных молекулярных фрагментов. Клик-химия – это не одна конкретная реакция, а подход к созданию продуктов, имитирующих природные процессы, в которых вещества образуются путем соединения небольших модульных блоков. Во многих приложениях клик-реакции соединяют биомолекулу и репортерную молекулу. Клик-химия не ограничивается биологическими условиями: концепция «клик-реакции» нашла применение в хемопротеомике, фармакологии, биомиметике и молекулярных машинах. Однако она оказалась особенно полезной для обнаружения, локализации и идентификации биомолекул. Клик-реакции проводятся в одной емкости, не нарушаются водой, дают минимальное количество безвредных побочных продуктов и характеризуются высокой термодинамической движущей силой, которая обеспечивает быстрое и необратимое протекание реакции с высоким выходом целевого продукта и высокой реакционной специфичностью (в некоторых случаях – с регио- и стереоспецифичностью). Эти качества делают клик-реакции особенно подходящими для решения задач выделения и направленного воздействия на молекулы в сложных биологических средах. В таких средах продукты должны быть физиологически стабильными, а любые побочные продукты – нетоксичными (для систем in vivo). Разрабатывая специфические и контролируемые биоортогональные реакции, ученые открыли возможность селективного воздействия на определенные мишени в сложных клеточных лизатах. Недавно клик-химию адаптировали для использования в живых клетках, например, с помощью малых молекул-зондов, которые находят и присоединяются к своим мишеням посредством клик-реакций. Несмотря на проблемы, связанные с проницаемостью клеток, биоортогональностью, фоновым мечением и эффективностью реакции, клик-реакции уже доказали свою полезность в новом поколении экспериментов по выделению (pull-down), в которых конкретные мишени могут быть изолированы с использованием, например, репортерных молекул, связывающихся с определенной колонкой, а также в флуоресцентной спектрометрии, где флуорофор присоединяется к интересующей мишени для ее количественного определения или локализации. В последнее время были разработаны новые методы включения партнеров для клик-реакций в биомолекулы, включая встраивание неестественных аминокислот, содержащих реактивные группы, в белки и модификацию нуклеотидов. Эти методы являются частью области химической биологии, в которой клик-химия играет фундаментальную роль, позволяя намеренно и специфически соединять модульные блоки для различных целей. Термин «клик-химия» был придуман женой К. Барри Шарплесса, Ян Дюзер, в 1998 году, а впервые полностью описан Шарплессом, Хартмутом К. Колбом и М. Г. Финном из Исследовательского института Скриппса в 2001 году. В 2022 году Нобелевская премия по химии была совместно присуждена Кэролин Р. Бертоцци, Мортену П. Мелдалю и К. Барри Шарплессу «за разработку клик-химии и биоортогональной химии».

In chemical synthesis, click chemistry is a class of simple, atom economy reactions commonly used for joining two molecular entities of choice. Click chemistry is not a single specific reaction, but describes a way of generating products that follow examples in nature, which also generates substances by joining small modular units. In many applications, click reactions join a biomolecule and a reporter molecule. Click chemistry is not limited to biological conditions: the concept of a "click" reaction has been used in chemoproteomic, pharmacological, biomimetic and molecular machinery applications. However, they have been made notably useful in the detection, localization and qualification of biomolecules. Click reactions occur in one pot, are not disturbed by water, generate minimal and inoffensive byproducts, and are "spring loaded"—characterized by a high thermodynamic driving force that drives it quickly and irreversibly to high yield of a single reaction product, with high reaction specificity (in some cases, with both regio and stereo specificity). These qualities make click reactions particularly suitable to the problem of isolating and targeting molecules in complex biological environments. In such environments, products accordingly need to be physiologically stable and any byproducts need to be non toxic (for in vivo systems). By developing specific and controllable bioorthogonal reactions, scientists have opened up the possibility of hitting particular targets in complex cell lysates. Recently, scientists have adapted click chemistry for use in live cells, for example using small molecule probes that find and attach to their targets by click reactions. Despite challenges of cell permeability, bioorthogonality, background labeling, and reaction efficiency, click reactions have already proven useful in a new generation of pulldown experiments (in which particular targets can be isolated using, for instance, reporter molecules which bind to a certain column), and fluorescence spectrometry (in which the fluorophore is attached to a target of interest and the target quantified or located). More recently, novel methods have been used to incorporate click reaction partners onto and into biomolecules, including the incorporation of unnatural amino acids containing reactive groups into proteins and the modification of nucleotides. These techniques represent a part of the field of chemical biology, in which click chemistry plays a fundamental role by intentionally and specifically coupling modular units to various ends. The term "click chemistry" was coined by K. Barry Sharpless' wife, Jan Dueser, in 1998, and was first fully described by Sharpless, Hartmuth C. Kolb, and M. G. Finn of The Scripps Research Institute in 2001. In 2022, the Nobel Prize in Chemistry was jointly awarded to Carolyn R. Bertozzi, Morten P. Meldal and K. Barry Sharpless, "for the development of click chemistry and bioorthogonal chemistry".

Предыстория

Химия клика – это метод присоединения зонда или субстрата, представляющего интерес, к конкретной биомолекуле, процесс, называемый биоконъюгацией. Возможность присоединения флуорофоров и других репортерных молекул сделала химию клика очень мощным инструментом для идентификации, локализации и характеристики как старых, так и новых биомолекул. Одним из самых ранних и важных методов биоконъюгации было экспрессирование репортера в той же открытой рамке считывания, что и биомолекула интереса. Примечательно, что зеленый флуоресцентный белок (GFP) впервые (и до сих пор) экспрессируется таким образом на N- или C-конце многих белков. Однако этот подход сопряжен с рядом трудностей. Например, GFP – это очень крупная единица, которая часто может влиять на сворачивание белка интереса. Более того, будучи экспрессированным на любом конце, аддукт GFP также может влиять на таргетинг и экспрессию желаемого белка. Наконец, с помощью этого метода GFP можно присоединять только к белкам, а не посттрансляционно, что исключает другие важные классы биомолекул (нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и т.д.) из области применения. Чтобы преодолеть эти проблемы, химики стали использовать пары биоортогональных реагентов, что позволяет использовать небольшие экзогенные молекулы в качестве биомолекулярных зондов. Флуорофор может быть присоединен к одному из этих зондов для получения флуоресцентного сигнала при связывании репортерной молекулы с мишенью, подобно тому, как флуоресцирует GFP при экспрессии с мишенью. Теперь ограничения возникают из-за химии взаимодействия зонда с его мишенью. Для того чтобы этот метод был полезен в биологических системах, реакции клик-химии должны протекать в биологических условиях или вблизи них, давать мало и (в идеале) нетоксичных побочных продуктов, приводить (предпочтительно) к образованию единственных и стабильных продуктов в тех же условиях и быстро протекать с высоким выходом в одной реакционной смеси. Существующие реакции, такие как лигация Штаудингера и 1,3-диполярное циклоприсоединение Хуисгена, были модифицированы и оптимизированы для таких реакционных условий. Сегодня исследования в этой области касаются не только понимания и разработки новых реакций, а также перепрофилирования и переосмысления известных реакций, но и расширения методов введения реагентов в живые системы, разработки новых реагентов и создания приложений для биоконъюгации. Биотехнологическая компания Shasqi использует химию клика в клинических исследованиях на людях.

Click chemistry is a method for attaching a probe or substrate of interest to a specific biomolecule, a process called bioconjugation. The possibility of attaching fluorophores and other reporter molecules has made click chemistry a very powerful tool for identifying, locating, and characterizing both old and new biomolecules. One of the earliest and most important methods in bioconjugation was to express a reporter on the same open reading frame as a biomolecule of interest. Notably, green fluorescent protein (GFP) was first (and still is) expressed in this way at the N or C terminus of many proteins. However, this approach comes with several difficulties. For instance, GFP is a very large unit and can often affect the folding of the protein of interest. Moreover, by being expressed at either terminus, the GFP adduct can also affect the targeting and expression of the desired protein. Finally, using this method, GFP can only be attached to proteins, and not post translationally, leaving other important biomolecular classes (nucleic acids, lipids, carbohydrates, etc.) out of reach. To overcome these challenges, chemists have opted to proceed by identifying pairs of bioorthogonal reaction partners, thus allowing the use of small exogenous molecules as biomolecular probes. A fluorophore can be attached to one of these probes to give a fluorescence signal upon binding of the reporter molecule to the target—just as GFP fluoresces when it is expressed with the target. Now limitations emerge from the chemistry of the probe to its target. In order for this technique to be useful in biological systems, click chemistry must run at or near biological conditions, produce little and (ideally) non toxic byproducts, have (preferably) single and stable products at the same conditions, and proceed quickly to high yield in one pot. Existing reactions, such as Staudinger ligation and the Huisgen 1,3 dipolar cycloaddition, have been modified and optimized for such reaction conditions. Today, research in the field concerns not only understanding and developing new reactions and repurposing and re understanding known reactions, but also expanding methods used to incorporate reaction partners into living systems, engineering novel reaction partners, and developing applications for bioconjugation. Biotech company Shasqi is a company leveraging click chemistry in humans.

Циклоаддиция азид-алкина, стимулируемая напряжением (SPAAC)

Группа Бертоцци дополнительно разработала одну из безмедных реакций «клик» Хьюсгена для преодоления цитотоксичности реакции CuAAC. Вместо использования Cu(I) для активации алкина, алкин вводят в напряжённое соединение (DIFO), в котором электроноакцепторные, пропаргильные атомы фтора, вместе с кольцевым напряжением, значительно дестабилизируют алкин. Эта дестабилизация увеличивает движущую силу реакции и стремление циклоалкина снять кольцевое напряжение. Реакция протекает как согласованное [3+2]-циклоприсоединение к тройной связи в циклооктине по тому же механизму, что и 1,3-диполярное циклоприсоединение Хьюсгена. В циклооктине также допускаются заместители, отличные от фтора, такие как бензольные кольца. Эта реакция успешно использовалась для поиска азидов в живых системах, хотя скорость реакции несколько ниже, чем у CuAAC. Более того, поскольку синтез циклооктинов часто даёт низкий выход, разработка зондов для этой реакции не была такой же быстрой, как для других реакций. Однако производные циклооктина, такие как DIFO, дибензилциклооктин (DIBO) и биарилазациклооктинон (BARAC), успешно применялись в реакции SPAAC для поиска азидов в живых системах.

Циклоаддиция алкина-нитрона, стимулируемая напряжением (SPANC)

Диариловые циклооктины, включая дибензилциклооктин (DIBO), также применялись для реакций с 1,3-нитронами в циклоприсоединениях алкинов и нитронов, стимулированных напряжением (SPANC), с образованием N-алкилированных изоксазолинов. Поскольку эта реакция не требует использования металлов и протекает с быстрой кинетикой (k2 достигает 60 1/Мс, что быстрее, чем в реакциях CuAAC или SPAAC), SPANC может быть использована для мечения живых клеток. Более того, допускается замещение как по углероду, так и по азоту нитронного диполя, а также использование ациклических и эндоциклических нитронов. Такая широкая допустимость обеспечивает значительную гибкость при введении нитронной метки или зонда. Однако изоксазолиновый продукт менее стабилен, чем триазольный продукт реакций CuAAC и SPAAC, и может подвергаться перегруппировкам в биологических условиях. Тем не менее, эта реакция остается весьма полезной благодаря своей заметно высокой скорости.

Реакции напряженных алкенов

Напряженные алкены также используют снятие напряжения как движущую силу, позволяющую им участвовать в реакциях «клик». Трансциклоалкены (обычно циклооктены) и другие напряженные алкены, такие как оксанорборнадиен, вступают в реакции «клик» с различными партнерами, включая азиды, тетразины и тетразолы. Эти партнеры по реакции могут специфически взаимодействовать с напряженным алкеном, оставаясь биоортогональными к эндогенным алкенам, содержащимся в липидах, жирных кислотах, кофакторах и других природных соединениях.

Алкен и тетразин - обратный спрос Диелс-Альдер

Напряженные циклооктены и другие активированные алкены реагируют с тетразинами в реакции Дильса-Альдера с обратным электронным требованием, за которой следует ретро [4+2]-циклоприсоединение (см. рисунок). Подобно другим реакциям транс-циклооктена, высвобождение кольцевого напряжения является движущей силой этой реакции. Следовательно, циклоалкены с тремя и четырьмя атомами в кольце, благодаря их высокой напряженности кольца, являются идеальными алкеновыми субстратами.

Алкен и тетразол фотокликовая реакция

Реакция "фотоклика" тетразолового алкена – еще одна реакция диполярного присоединения, впервые представленная Хьюсгеном в конце 1960-х годов (ChemBioChem 2007, 8, 1504. (68) Clovis, J. S.; Eckell, A.; Huisgen, R.; Sustmann, R. Chem. Ber. 1967, 100, 60). Тетразолы с амино- или стирильными группами, которые могут быть активированы УФ-светом на длине волны 365 нм (365 нм не повреждает клетки), быстро реагируют (так, что УФ-свет не требуется включать на длительное время, обычно около 1–4 минут), образуя флуорогенные пиразолиновые продукты. Эта схема реакции хорошо подходит для маркировки в живых клетках, поскольку УФ-свет на 365 нм оказывает минимальное повреждающее воздействие на клетки. Более того, реакция протекает быстро, что позволяет использовать УФ-излучение короткими импульсами. Квантовые выходы для УФ-света с короткой длиной волны могут превышать 0,5. Это позволяет использовать тетразолы селективно по длине волны в сочетании с другой фотолигационной реакцией, где на короткой длине волны тетразольная лигация протекает практически исключительно, а на большей длине волны – другая реакция (лигация через о-хинодиметаны) протекает исключительно. Наконец, нефлуоресцирующие реагенты приводят к образованию флуоресцирующего продукта, обеспечивая реакцию встроенным инструментом для спектрометрии. Как тетразолы, так и алкеновые группы были включены в качестве белковых "ручек" в виде неестественных аминокислот, однако это преимущество не является уникальным. Вместо этого фотоиндуцируемость реакции делает ее основным кандидатом для пространственно-временной специфичности в живых системах. К проблемам относится наличие эндогенных алкенов, которые, хотя обычно находятся в цис-конфигурации (как в жирных кислотах), все же могут реагировать с активированным тетразолом.

Лицензия на технологию

У Исследовательского института Скриппса есть портфель патентов в области химии клика. Среди лицензиатов – Invitrogen, Allozyne, Aileron, Integrated Diagnostics и биотехнологическая компания, выделенная из BASF для продажи продуктов, созданных с использованием химии клика. Кроме того, компания обладает эксклюзивной всемирной лицензией для рынка исследований и диагностики в области нуклеиновых кислот. Флуоресцентные азиды и алкины также производятся такими компаниями, как Cyandye.