Введение
Пара клонированных овец Полли и Молли (родившиеся в 1997 году), две овцы, были первыми млекопитающими, успешно клонированными из взрослой соматической клетки и одновременно являвшимися трансгенными животными. Это не следует путать с овцой Долли, первым животным, успешно клонированным из взрослой соматической клетки без модификации донорского ядра взрослого организма. Полли и Молли, как и овца Долли, были клонированы в Институте Рослина в Эдинбурге, Шотландия. Создание Полли и Молли опиралось на эксперименты по переносу соматического ядра, приведшие к клонированию овцы Долли. Ключевое отличие заключалось в том, что для создания Полли и Молли ученые использовали клетки, в которые был введен новый ген. Выбранный ген кодировал терапевтический белок, чтобы продемонстрировать потенциал технологии рекомбинантной ДНК в сочетании с клонированием животных. Это могло быть использовано для производства фармакологических и терапевтических белков для лечения заболеваний человека. Речь шла о факторе свертывания крови IX человека. Другим отличием от овцы Долли был тип клеток, из которых было взято ядро для переноса. Хотя Полли и Молли были ядерными клонами, их митохондриальная ДНК (мтДНК) отличалась от ДНК ядерных клеток, предоставивших им генетический материал. До появления Полли и Молли единственным известным способом создания трансгенного животного была микроинъекция ДНК в пронуклеи оплодотворенных яйцеклеток. Однако лишь небольшая часть животных интегрирует инъецированную ДНК в свой геном. В редких случаях, когда интеграция происходит, уровень экспрессии белка трансгена из-за случайного места вставки сильно варьируется. Поскольку целью таких исследований является получение животного, экспрессирующего определенный белок в высоких концентрациях, например, в молоке, микроинъекция – дорогостоящая процедура, которая обычно не дает желаемого результата. У мышей существует дополнительный вариант генетической модификации, недоступный другим животным. Эмбриональные стволовые клетки позволяют переносить новую ДНК в зародышевую линию и точно изменять гены с помощью генного таргетинга. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки можно отбирать in vitro перед дальнейшим производством животного. Эмбриональные стволовые клетки, способные вносить вклад в зародышевую линию сельскохозяйственных животных, таких как овцы, не были выделены. Клонирование овцы Долли, а также овец Меган и Мораг, приведших к созданию Долли, показало, что жизнеспособных овец можно получить путем переноса ядра из различных типов соматических клеток, культивированных in vitro. Полли и Молли представляли собой следующий шаг, в котором соматические клетки также культивировались in vitro. Однако в этом случае они были трансфицированы чужеродной ДНК, и были отобраны клетки, стабильно интегрировавшие этот новый генетический материал. Затем ядра этих соматических клеток были перенесены в неоплодотворенную яйцеклетку, как в процедуре переноса ядра, для получения нескольких трансгенных животных. Использовался клеточный тип PDFF. PDFF5 давал бы мужских особей и не был трансдуцирован. Клетки типа PDFF2 давали женских особей и были трансдуцированы. Из произошедших беременностей родились три животных PDFF2, двое из которых выжили после рождения – 7LL8 и 7LL12. Эти животные были трансфицированы, но содержали маркерный ген, а не интересующий клонированный ген. Их назвали Холли и Олли. Еще две субпопуляции клеток PDFF2, производящих самок, PDFF2 12 и PDFF2 13, также дали потомство, содержащее интересующую клетку вместе с маркером. Из этих ягнят 7LL12, 7LL15 и 7LL13 родились живыми и здоровыми. Двое из них были названы Полли и Молли.
Polly and Molly (born 1997), two ewes, were the first mammals to have been successfully cloned from an adult somatic cell and to be transgenic animals at the same time. This is not to be confused with Dolly the Sheep, the first animal to be successfully cloned from an adult somatic cell where there wasn’t modification carried out on the adult donor nucleus. Polly and Molly, like Dolly the Sheep, were cloned at the Roslin Institute in Edinburgh, Scotland. The creation of Polly and Molly built on the somatic nuclear transfer experiments that led to the cloning of Dolly the Sheep. The crucial difference was that in creating Polly and Molly, scientists used cells into which a new gene had been inserted. The gene chosen was a therapeutic protein to demonstrate the potential of such recombinant DNA technology combined with animal cloning. This could hopefully be used to produce pharmacological and therapeutic proteins to treat human diseases. The protein in question was the human blood clotting factor IX. Another difference from Dolly the Sheep was the source cell type of the nucleus that was transferred. Although Polly and Molly were nuclear clones, they had different mtDNA that was different from the nuclear cells where they received their DNA. Prior to the production of Polly and Molly, the only demonstrated way to make a transgenic animal was by microinjection of DNA into the pronuclei of fertilized oocytes (eggs). However, only a small proportion of the animals will integrate the injected DNA into their genome. In the rare cases that they do integrate this new genetic information, the pattern of expression of the injected transgene's protein due to the random integration is very variable. As the aim of such research is to produce an animal that expresses a particular protein in high levels in, for example, its milk, microinjection is a very costly procedure that does not usually produce the desired animal. In mice, there is an additional option for genetic transfer that is not available in other animals. Embryonic stem cells provide a means to transfer new DNA into the germline. They also allow precise genetic modifications by gene targeting. Modified embryonic stem cells can be selected in vitro before the experiment moves on further for the production of an animal. Embryonic stem cells capable of contributing to the germline of livestock species such as sheep have not been isolated. The production of Dolly the Sheep and also Megan and Morag, the two sheep that led to the production of Dolly, demonstrated that viable sheep can be produced by nuclear transfer from a variety of somatic cell types which have been cultured in vitro. Polly and Molly represented the further step in which somatic cells were cultured in vitro, just as in the case with the previous sheep. However, in this case they were transfected with foreign DNA, and the transfected cells which stably integrated this new piece of genetic information were selected. The nuclei of these somatic cells was then transferred into an empty oocyte, as in the procedure of nuclear transfer, and this was used to produce several transgenic animals. A cell type PDFF was used. PDFF5 would produce male animals and were not transduced. Cell type PDFF2 produced female animals and were transduced. Of the gestations that occurred, three PDFF2 animals were born, two of which survived birth, 7LL8 and 7LL12. These animals were transfected but contained a marker gene not the cloned gene of interest. These were named "Holly" and "Olly". Two more subsets of female producing PDFF2 cells, PDFF2 12 and PDFF2 13, also produced animals which had the cell of interest together with the marker. Of these lambs, 7LL12, 7LL15, and 7LL13 were born alive and healthy. Two of these were named Polly and Molly.
Трансгены
Трансген, который был введен в соматические клетки донора, был сконструирован для экспрессии белка человеческого фактора свертывания IX в молоке овец. Этот белок играет ключевую роль в свертывании крови, а его дефицит приводит к заболеванию гемофилии B, лечение которого требует внутривенных инфузий фактора IX. Производство этого белка в молоке сельскохозяйственных животных, процесс, известный как фарминг, обеспечит источник этого терапевтического белка, что позволит снизить стоимость и исключить потенциальный инфекционный риск, связанный с текущим источником этого белка (человеческая кровь).