Введение
Белок репарации ДНК RecA — это 38-килодальтонный белок, необходимый для репарации и поддержания ДНК. Структурный и функциональный гомолог RecA был обнаружен у каждого вида, в котором его целенаправленно искали, и служит архетипом для этого класса гомологичных белков репарации ДНК. Гомологичный белок называется RAD51 у эукариот и RadA у архей. RecA обладает множеством активностей, все из которых связаны с репарацией ДНК. В бактериальном SOS-ответе он выполняет функцию копротеазы в автокаталитическом расщеплении репрессора LexA и λ-репрессора. Связь RecA с репарацией ДНК обусловлена его центральной ролью в гомологичной рекомбинации. Белок RecA прочно и длинными кластерами связывается с одноцепочечной ДНК (ssDNA), образуя нуклеопротеиновую нить. Белок имеет более одного сайта связывания ДНК и, таким образом, может удерживать вместе одноцепочечную и двухцепочечную ДНК. Эта особенность позволяет катализировать реакцию синапса ДНК между двухцепочечной спиралью ДНК и комплементарным участком одноцепочечной ДНК. Нить RecA-ssDNA осуществляет поиск сходства последовательностей вдоль двухцепочечной ДНК (dsDNA). Деформированный участок ДНК в RecA, петля 2, содержит остатки, ответственные за гомологичную рекомбинацию ДНК. У некоторых бактерий посттрансляционная модификация RecA посредством фосфорилирования серинового остатка в петле 2 может препятствовать гомологичной рекомбинации. Процесс поиска индуцирует растяжение дуплекса ДНК, что усиливает распознавание комплементарности последовательностей (механизм, называемый конформационной корректурой). Реакция инициирует обмен цепями между двумя рекомбинирующими двухцепочечными спиралями ДНК. После события синапса в гетеродуплексной области начинается процесс, называемый миграцией ветвей. При миграции ветвей непоспаренная область одной из одноцепочечных нитей вытесняет спаренную область другой одноцепочечной нити, перемещая точку ветвления без изменения общего числа пар оснований. Спонтанная миграция ветвей может происходить, однако, поскольку она обычно протекает одинаково в обоих направлениях, маловероятно, что она эффективно завершит рекомбинацию. Белок RecA катализирует однонаправленную миграцию ветвей и тем самым позволяет завершить рекомбинацию, создавая область гетеродуплексной ДНК длиной в тысячи пар оснований. Поскольку RecA является ДНК-зависимой АТФазой, он содержит дополнительный сайт для связывания и гидролиза АТФ. RecA связывается с ДНК более прочно, когда связан АТФ, чем когда связан АДФ. У Escherichia coli события гомологичной рекомбинации, опосредованные RecA, могут происходить в период после репликации ДНК, когда сестринские локусы остаются близкими. RecA также может опосредовать спаривание гомологов, гомологичную рекомбинацию и репарацию разрывов ДНК между отдаленными сестринскими локусами, которые разошлись к противоположным половинам клетки E. coli. Штаммы E. coli, дефицитные по RecA, полезны для процедур клонирования в лабораториях молекулярной биологии. Штаммы E. coli часто генетически модифицируют для содержания мутантного аллеля recA, тем самым обеспечивая стабильность экстрахромосомных сегментов ДНК, известных как плазмиды. В процессе, называемом трансформацией, плазмидная ДНК поглощается бактериями в различных условиях. Бактерии, содержащие экзогенные плазмиды, называются "трансформантами". Трансформанты сохраняют плазмиду на протяжении клеточных делений, что позволяет восстановить и использовать ее в других приложениях. Без функционального белка RecA экзогенная плазмидная ДНК остается неизменной для бактерий. Очистка этого плазмида из бактериальных культур может затем позволить высокоточное ПЦР-амплификацию исходной последовательности плазмида.
RecA is a 38 kilodalton protein essential for the repair and maintenance of DNA. A RecA structural and functional homolog has been found in every species in which one has been seriously sought and serves as an archetype for this class of homologous DNA repair proteins. The homologous protein is called RAD51 in eukaryotes and RadA in archaea. RecA has multiple activities, all related to DNA repair. In the bacterial SOS response, it has a co protease function in the autocatalytic cleavage of the LexA repressor and the λ repressor. RecA's association with DNA repair is based on its central role in homologous recombination. The RecA protein binds strongly and in long clusters to ssDNA to form a nucleoprotein filament. The protein has more than one DNA binding site, and thus can hold a single strand and double strand together. This feature makes it possible to catalyze a DNA synapsis reaction between a DNA double helix and a complementary region of single stranded DNA. The RecA ssDNA filament searches for sequence similarity along the dsDNA. A disordered DNA loop in RecA, Loop 2, contains the residues responsible for DNA homologous recombination. In some bacteria, RecA posttranslational modification via phosphorylation of a serine residue on Loop 2 can interfere with homologous recombination. The search process induces stretching of the DNA duplex, which enhances sequence complementarity recognition (a mechanism termed conformational proofreading). The reaction initiates the exchange of strands between two recombining DNA double helices. After the synapsis event, in the heteroduplex region a process called branch migration begins. In branch migration an unpaired region of one of the single strands displaces a paired region of the other single strand, moving the branch point without changing the total number of base pairs. Spontaneous branch migration can occur, however, as it generally proceeds equally in both directions it is unlikely to complete recombination efficiently. The RecA protein catalyzes unidirectional branch migration and by doing so makes it possible to complete recombination, producing a region of heteroduplex DNA that is thousands of base pairs long. Since it is a DNA dependent ATPase, RecA contains an additional site for binding and hydrolyzing ATP. RecA associates more tightly with DNA when it has ATP bound than when it has ADP bound. In Escherichia coli, homologous recombination events mediated by RecA can occur during the period after DNA replication when sister loci remain close. RecA can also mediate homology pairing, homologous recombination and DNA break repair between distant sister loci that had segregated to opposite halves of the E. coli cell. E. coli strains deficient in RecA are useful for cloning procedures in molecular biology laboratories. E. coli strains are often genetically modified to contain a mutant recA allele and thereby ensure the stability of extrachromosomal segments of DNA, known as plasmids. In a process called transformation, plasmid DNA is taken up by the bacteria under a variety of conditions. Bacteria containing exogenous plasmids are called "transformants". Transformants retain the plasmid throughout cell divisions such that it can be recovered and used in other applications. Without functional RecA protein, the exogenous plasmid DNA is left unaltered by the bacteria. Purification of this plasmid from bacterial cultures can then allow high fidelity PCR amplification of the original plasmid sequence.
Потенциал в качестве цели для наркотиков
Вигл и Синглтон из Университета Северной Каролины показали, что небольшие молекулы, вмешивающиеся в функцию RecA в клетке, могут быть полезны в разработке новых антибиотиков. Поскольку многие антибиотики вызывают повреждение ДНК, а все бактерии используют RecA для восстановления этого повреждения, ингибиторы RecA могут быть использованы для повышения токсичности антибиотиков. Более того, активность RecA тесно связана с развитием устойчивости к антибиотикам, и ингибиторы RecA также могут замедлить или предотвратить появление лекарственной устойчивости у бактерий.
Роль RecA в естественном преобразовании
На основании анализа молекулярных свойств системы RecA, Кокс пришел к выводу, что данные "предоставляют убедительные доказательства того, что основная функция белка RecA – восстановление ДНК". В дальнейшей работе, посвященной функции белка RecA, Кокс обобщил данные, демонстрирующие, что "белок RecA эволюционировал как центральный компонент системы рекомбинационного восстановления ДНК, при этом генерация генетического разнообразия является иногда полезным побочным продуктом". Естественная бактериальная трансформация включает в себя передачу ДНК от одной бактерии к другой (обычно одного и того же вида) и интеграцию донорной ДНК в хромосому реципиента посредством гомологичной рекомбинации – процесс, опосредованный белком RecA (см. Трансформация (генетика)). Трансформация, в которой RecA играет центральную роль, зависит от экспрессии многочисленных дополнительных генных продуктов (например, около 40 генных продуктов у Bacillus subtilis), которые специфически взаимодействуют для осуществления этого процесса, что указывает на то, что это эволюционировавшая адаптация для передачи ДНК. У B. subtilis длина передаваемой ДНК может составлять до трети и до размера целой хромосомы. Чтобы бактерия могла связываться, поглощать и рекомбинировать экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна сначала перейти в особое физиологическое состояние, называемое "компетентностью" (см. Естественная компетентность). Трансформация широко распространена в прокариотическом мире, и на сегодняшний день известно 67 видов, компетентных к трансформации. Одной из наиболее изученных систем трансформации является система B. subtilis. В этой бактерии белок RecA взаимодействует с поступающей одноцепочечной ДНК (ssDNA), образуя поразительные нитевидные структуры. Эти нити RecA/ssDNA исходят из полюса клетки, содержащего компетентный механизм, и простираются в цитозоль. Нитевидные структуры RecA/ssDNA рассматриваются как динамические нуклеофиламенты, сканирующие геномную ДНК в поисках областей гомологии. Этот процесс направляет поступающую ДНК в соответствующее место в хромосоме B. subtilis, где происходит обмен информацией. Миход и соавторы проанализировали данные, свидетельствующие о том, что трансформация, опосредованная RecA, является адаптацией для гомологичного рекомбинационного восстановления повреждений ДНК у B. subtilis, а также у нескольких других видов бактерий (например, Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans и Helicobacter pylori). В случае патогенных видов, инфицирующих человека, было предложено, что восстановление повреждений ДНК, опосредованное RecA, может приносить существенную пользу этим бактериям при столкновении с окислительной защитой хозяина.