Аптамеры: искусственные молекулы для специфического связывания и применения в медицине и биологии.

Введение

Олигонуклеотидные или пептидные молекулы, связывающие специфические мишени.

Аптамеры – это короткие последовательности искусственной ДНК, РНК, XNA или пептида, которые связывают определенную молекулу-мишень или семейство молекул-мишеней. Они демонстрируют широкий диапазон аффинности (KD в пределах от пМ до мкМ), с переменным уровнем неспецифического связывания и иногда классифицируются как химические антитела. Аптамеры и антитела могут использоваться во многих одних и тех же областях применения, но структура аптамеров, основанная на нуклеиновых кислотах, состоящая в основном из олигонуклеотидов, существенно отличается от аминокислотной структуры антител, которые являются белками. Это различие может сделать аптамеры предпочтительнее антител для определенных целей (см. замену антител). Аптамеры используются в биологических лабораторных исследованиях и медицинских тестах. Если несколько аптамеров объединяются в один анализ, они могут измерять большое количество различных белков в образце. Они могут использоваться для выявления молекулярных маркеров заболеваний или функционировать как лекарственные средства, системы доставки лекарств и системы контролируемого высвобождения лекарств. Они также находят применение в других задачах молекулярной инженерии. Большинство аптамеров получают с помощью SELEX – семейства экспериментов в пробирке, предназначенных для поиска полезных аптамеров в огромном пуле различных последовательностей ДНК. Этот процесс аналогичен естественному отбору, направленной эволюции или искусственному отбору. В SELEX исследователь многократно отбирает лучшие аптамеры из исходной библиотеки ДНК, состоящей примерно из квадриллиона различных случайно сгенерированных фрагментов ДНК или РНК. После SELEX исследователь может мутировать или изменить химию аптамеров и провести повторный отбор, или использовать рациональный дизайн для улучшения их свойств. Существуют также методы обнаружения аптамеров, не основанные на SELEX. Исследователи оптимизируют аптамеры для достижения различных полезных характеристик. Наиболее важной характеристикой является специфичное и чувствительное связывание с выбранной мишенью. При воздействии аптамеров на биологические жидкости, например, в сыворотке или при аптамерной терапии, часто важно, чтобы они были устойчивы к расщеплению ДНК- и РНК-разрушающими белками. Терапевтические аптамеры часто необходимо модифицировать для замедления их выведения из организма. Аптамеры, которые значительно меняют свою форму при связывании с мишенью, полезны в качестве молекулярных переключателей для включения и выключения сенсоров. Некоторые аптамеры разрабатываются для интеграции в биосенсоры или тесты биологических образцов. В некоторых случаях может быть полезно, чтобы аптамер достигал заранее определенного уровня или скорости связывания. Поскольку выход синтеза, используемого для производства известных аптамеров, быстро снижается для более длинных последовательностей, исследователи часто укорачивают аптамеры до минимальной связывающей последовательности, чтобы снизить производственные затраты.

Aptamers are short sequences of artificial DNA, RNA, XNA, or peptide that bind a specific target molecule, or family of target molecules. They exhibit a range of affinities (KD in the pM to μM range), with variable levels of off target binding and are sometimes classified as chemical antibodies. Aptamers and antibodies can be used in many of the same applications, but the nucleic acid based structure of aptamers, which are mostly oligonucleotides, is very different from the amino acid based structure of antibodies, which are proteins. This difference can make aptamers a better choice than antibodies for some purposes (see antibody replacement). Aptamers are used in biological lab research and medical tests. If multiple aptamers are combined into a single assay, they can measure large numbers of different proteins in a sample. They can be used to identify molecular markers of disease, or can function as drugs, drug delivery systems and controlled drug release systems. They also find use in other molecular engineering tasks. Most aptamers originate from SELEX, a family of test tube experiments for finding useful aptamers in a massive pool of different DNA sequences. This process is much like natural selection, directed evolution or artificial selection. In SELEX, the researcher repeatedly selects for the best aptamers from a starting DNA library made of about a quadrillion different randomly generated pieces of DNA or RNA. After SELEX, the researcher might mutate or change the chemistry of the aptamers and do another selection, or might use rational design processes to engineer improvements. Non SELEX methods for discovering aptamers also exist. Researchers optimize aptamers to achieve a variety of beneficial features. The most important feature is specific and sensitive binding to the chosen target. When aptamers are exposed to bodily fluids, as in serum tests or aptamer therapeutics, it is often important for them to resist digestion by DNA and RNA destroying proteins. Therapeutic aptamers often must be modified to clear slowly from the body. Aptamers that change their shape dramatically when they bind their target are useful as molecular switches to turn a sensor on and off. Some aptamers are engineered to fit into a biosensor or in a test of a biological sample. It can be useful in some cases for the aptamer to accomplish a pre defined level or speed of binding. As the yield of the synthesis used to produce known aptamers shrinks quickly for longer sequences, researchers often truncate aptamers to the minimal binding sequence to reduce the production cost.

Этимология

Слово "аптамер" — это неологизм, предложенный Эндрю Эллингтоном и Джеком Шостаком в их первой публикации на эту тему. Они не дали точного определения, указав: «Мы назвали эти отдельные последовательности РНК «аптамерами», от латинского *aptus* — «пригодный», «способный подходить»». Само слово, однако, происходит от греческого глагола ἅπτω, означающего «соединять» или «присоединять» (как использовал Гомер ок. VIII века до н.э.), и μέρος, — часть, компонент чего-либо большего.

Классификация

Типичный аптамер – это синтетически созданный лиганд, использующий комбинаторное разнообразие ДНК, РНК, XNA или пептидов для достижения прочного и специфичного связывания с конкретной целевой молекулой или семейством целевых молекул. Аптамеры иногда называют "химическими антителами" или "антителами-мимиками". Однако большинство аптамеров имеют небольшую молекулярную массу – 6-30 кДа, в отличие от 150 кДа у антител, и содержат один сайт связывания, а не две области связывания антигена, характерные для типичного антитела.

История

С момента первого применения в 1967 году методологии направленной эволюции использовались для разработки биомолекул с новыми свойствами и функциями. Ранние примеры включают модификацию репликационной системы бактериофага Qbeta и создание рибозимов с измененной активностью расщепления. В 1990 году две группы независимо разработали и опубликовали методы SELEX (Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) и сгенерировали аптамеры РНК: лаборатория Ларри Голда, использовавшая термин SELEX для описания процесса отбора лигандов РНК против T4 ДНК-полимеразы, и лаборатория Джека Шостака, отбиравшая лиганды РНК против различных органических красителей. Два года спустя лаборатория Шостака и компания Gilead Sciences, действуя независимо друг от друга, использовали схемы in vitro-селекции для создания аптамеров ДНК к органическим красителям и человеческому тромбину соответственно. В 2001 году J. Colin Cox в лаборатории Ellington автоматизировал SELEX, сократив продолжительность эксперимента по отбору с нескольких недель до трех дней. В 2002 году две группы под руководством Рональда Брейкера и Евгения Нудлера опубликовали первые убедительные доказательства существования рибосвитча – генетического регуляторного элемента на основе нуклеиновых кислот, существование которого ранее предполагалось. Рибосвитчи обладают сходными свойствами молекулярного распознавания с аптамерами. Это открытие укрепило гипотезу мира РНК, постулируемую стадию в происхождении жизни на Земле.

Структура

Большинство аптамеров основаны на специфической олигомерной последовательности из 20–100 оснований и имеют молекулярную массу 3–20 кДа. Некоторые имеют химические модификации для улучшения функциональных характеристик или совместимости с более крупными сконструированными молекулярными системами. Химия ДНК, РНК, XNA и пептидных аптамеров может предлагать различные профили с точки зрения стабильности при хранении, устойчивости в сыворотке или in vivo, специфичности и чувствительности, стоимости, простоты получения, амплификации и характеризации, а также удобства для пользователей. Как правило, аптамеры на основе ДНК и РНК обладают низкой иммуногенностью, могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и имеют сложную вторичную и третичную структуру. Аптамеры на основе ДНК и XNA демонстрируют превосходную стабильность при хранении. Аптамеры на основе XNA могут вводить дополнительное химическое разнообразие для повышения аффинности связывания или большей устойчивости в сыворотке или in vivo. Поскольку существует 22 генетически закодированных и более 500 природных аминокислот, пептидные аптамеры, как и антитела, обладают гораздо большим потенциальным комбинаторным разнообразием на единицу длины по сравнению с 4 нуклеиновыми кислотами в ДНК или РНК. Химические модификации оснований нуклеиновых кислот или их остова увеличивают химическое разнообразие стандартных оснований нуклеиновых кислот. Разделенные аптамеры состоят из двух или более цепей ДНК, которые являются фрагментами большего родительского аптамера, разделенного молекулярным разрывом. Способность каждого фрагмента связывать мишень будет зависеть от места разрыва, а также от вторичной структуры дочерних цепей. Присутствие молекулы-мишени способствует соединению фрагментов ДНК, что может быть использовано в качестве основы для биосенсоров. После сборки две отдельные цепи ДНК могут быть лигированы в одну цепь. Немодифицированные аптамеры быстро выводятся из кровотока с периодом полураспада от секунд до часов, главным образом из-за деградации нуклеазами, которые физически разрушают аптамеры, а также из-за клиренса почками, обусловленного низкой молекулярной массой и размером аптамера. Несколько модификаций, таких как 2'-фторзамещенные пиримидины и конъюгация с полиэтиленгликолем (ПЭГ), позволяют достичь периода полураспада в сыворотке от дней до недель. ПЭГилирование может добавить достаточную массу и размер, чтобы предотвратить клиренс почками in vivo. Немодифицированные аптамеры могут использоваться для лечения нарушений свертываемости крови. Проблема клиренса и нуклеазного расщепления уменьшается при их применении к глазу, где концентрация нуклеаз ниже и скорость клиренса меньше. Быстрый клиренс из сыворотки также может быть полезен в некоторых приложениях, таких как диагностическая визуализация in vivo. В исследовании аптамеров, предназначенных для связывания с белками, связанными с инфекцией Эбола, было проведено сравнение трех аптамеров, выделенных по их способности связываться с белком-мишенью EBOV sGP. Хотя эти аптамеры различаются по последовательности и структуре, они демонстрируют удивительно схожую относительную аффинность к sGP от EBOV и SUDV, а также к EBOV GP1.2. Эти аптамеры продемонстрировали высокую степень специфичности к продуктам гена GP. Один аптамер, в частности, оказался эффективным в качестве распознающего элемента в электрохимическом сенсоре, позволяя обнаруживать sGP и GP1.2 в растворе, а также GP1.2 в мембранном контексте. Результаты этого исследования указывают на интригующую возможность того, что определенные области на поверхности белков могут обладать аптатропными свойствами. Выявление ключевых особенностей таких участков в сочетании с улучшенными 3D структурными прогнозами для аптамеров может повысить точность прогнозирования участков взаимодействия аптамеров с белками. Это, в свою очередь, может помочь идентифицировать аптамеры с повышенной вероятностью связывания с белками с высокой аффинностью, а также пролить свет на мутации белков, которые могут значительно повлиять на связывание аптамера. Это всестороннее понимание структурных взаимодействий между аптамерами и белками имеет важное значение для повышения вычислительной предсказуемости связывания аптамер-белок и может в конечном итоге устранить необходимость в экспериментальном протоколе SELEX.

Most aptamers are based on a specific oligomer sequence of 20 100 bases and 3 20 kDa. Some have chemical modifications for functional enhancements or compatibility with larger engineered molecular systems. DNA, RNA, XNA, and peptide aptamer chemistries can each offer distinct profiles in terms of shelf stability, durability in serum or in vivo, specificity and sensitivity, cost, ease of generation, amplification, and characterization, and familiarity to users. Typically, DNA and RNA based aptamers exhibit low immunogenicity, are amplifiable via Polymerase Chain Reaction (PCR), and have complex secondary structure and tertiary structure. DNA and XNA based aptamers exhibit superior shelf stability. XNA based aptamers can introduce additional chemical diversity to increase binding affinity or greater durability in serum or in vivo. As 22 genetically encoded and over 500 naturally occurring amino acids exist, peptide aptamers, as well as antibodies, have much greater potential combinatorial diversity per unit length relative to the 4 nucleic acids in DNA or RNA. Chemical modifications of nucleic acid bases or backbones increase the chemical diversity of standard nucleic acid bases. Split aptamers are composed of two or more DNA strands that are pieces of a larger parent aptamer that has been broken in two by a molecular nick. The ability of each component strand to bind targets will depend on the location of the nick, as well as the secondary structures of the daughter strands. The presence of a target molecule supports the joining of DNA fragments. This can be used as the basis for biosensors. Once assembled, the two separate DNA strands can be ligated into a single strand. Unmodified aptamers are cleared rapidly from the bloodstream, with a half life of seconds to hours. This is mainly due to nuclease degradation, which physically destroys the aptamers, as well as clearance by the kidneys, a result of the aptamer's low molecular weight and size. Several modifications, such as 2' fluorine substituted pyrimidines and polyethylene glycol (PEG) linkage, permit a serum half life of days to weeks. PEGylation can add sufficient mass and size to prevent clearance by the kidneys in vivo. Unmodified aptamers can treat coagulation disorders. The problem of clearance and nuclease digestion is diminished when they are applied to the eye, where there is a lower concentration of nuclease and the rate of clearance is lower. Rapid clearance from serum can also be useful in some applications, such as in vivo diagnostic imaging. In a study on aptamers designed to bind with proteins associated with Ebola infection, a comparison was made among three aptamers isolated for their ability to bind the target protein EBOV sGP. Although these aptamers vary in both sequence and structure, they exhibit remarkably similar relative affinities for sGP from EBOV and SUDV, as well as EBOV GP1.2. Notably, these aptamers demonstrated a high degree of specificity for the GP gene products. One aptamer, in particular, proved effective as a recognition element in an electrochemical sensor, enabling the detection of sGP and GP1.2 in solution, as well as GP1.2 within a membrane context. The results of this research point to the intriguing possibility that certain regions on protein surfaces may possess aptatropic qualities. Identifying the key features of such sites, in conjunction with improved 3 D structural predictions for aptamers, holds the potential to enhance the accuracy of predicting aptamer interaction sites on proteins. This, in turn, may help identify aptamers with a heightened likelihood of binding proteins with high affinity, as well as shed light on protein mutations that could significantly impact aptamer binding. This comprehensive understanding of the structure based interactions between aptamers and proteins is vital for refining the computational predictability of aptamer protein binding. Moreover, it has the potential to eventually eliminate the need for the experimental SELEX protocol.

Цели

Цели аптамеров могут включать в себя малые молекулы и ионы тяжелых металлов, более крупные лиганды, такие как белки, и даже целые клетки. К этим мишеням относятся лизоцим, тромбин, транс-активирующий элемент вируса иммунодефицита человека (TAR ВИЧ), гемин, интерферон γ, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), простатспецифический антиген (PSA), дофамин и некодирующий онкоген, фактор теплового шока 1 (HSF1). Аптамеры были получены против раковых клеток, прионов, бактерий и вирусов. Вирусными мишенями для аптамеров являются вирусы гриппа A и B, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ).

Аптамеры могут быть особенно полезны в протеомике экологических исследований. Антитела, как и другие белки, сложнее секвенировать, чем нуклеиновые кислоты. Их также дороже поддерживать и производить, и они постоянно подвержены риску контаминации, поскольку производятся с помощью клеточной культуры или выделяются из сыворотки животных. По этой причине исследователи, заинтересованные в малоизученных белках и видах, могут столкнуться с тем, что компании не будут производить, поддерживать или адекватно валидировать качество антител к интересующей их мишени. В отличие от этого, аптамеры легко секвенировать и не требуют затрат на поддержание, поскольку их точная структура может быть сохранена в цифровом виде и синтезирована по требованию. Это может сделать их более экономически целесообразными в качестве исследовательских инструментов для недостаточно финансируемых биологических исследований. Аптамеры существуют для растительных соединений, таких как теофиллин (содержится в чае) и абсцизовая кислота (растительный иммунный гормон). Разработан аптамер против аманитина (токсина, вызывающего смертельное отравление бледной поганкой), что является примером аптамера против мишени гриба. Области применения аптамеров можно условно разделить на сенсорные, терапевтические, производство реагентов и инженерные. Сенсорные приложения важны в экологических, биомедицинских, эпидемиологических, областях биобезопасности и фундаментальных исследований, где аптамеры выступают в качестве зондов в анализах, методах визуализации, диагностических тестах и биосенсорах. В терапевтических приложениях и прецизионной медицине аптамеры могут функционировать как лекарства, как средства целевой доставки лекарств, как механизмы контролируемого высвобождения и как реагенты для поиска лекарств с помощью высокопроизводительного скрининга малых молекул и белков. Аптамеры применяются для мониторинга производства белков, контроля качества и очистки. Они могут использоваться в молекулярной инженерии для модификации белков, например, для повышения эффективности ДНК-полимеразы и повышения надежности ПЦР. Поскольку аффинность аптамера также влияет на его динамический диапазон и предел обнаружения, аптамеры с более низкой аффинностью могут быть предпочтительны при анализе высоких концентраций целевой молекулы. Аффинная хроматография также зависит от способности аффинного реагента, такого как аптамер, связывать и высвобождать свою мишень, и более низкая аффинность может способствовать высвобождению целевой молекулы. Таким образом, конкретные области применения определяют полезный диапазон аффинности аптамера.

Aptamers may be particularly useful for environmental science proteomics. Antibodies, like other proteins, are more difficult to sequence than nucleic acids. They are also costly to maintain and produce, and are at constant risk of contamination, as they are produced via cell culture or are harvested from animal serum. For this reason, researchers interested in little studied proteins and species may find that companies will not produce, maintain, or adequately validate the quality of antibodies against their target of interest. By contrast, aptamers are simple to sequence and cost nothing to maintain, as their exact structure can be stored digitally and synthesized on demand. This may make them more economically feasible as research tools for underfunded biological research subjects. Aptamers exist for plant compounds, such as theophylline (found in tea) and abscisic acid (a plant immune hormone). An aptamer against a amanitin (the toxin that causes lethal Amanita poisoning) has been developed, an example of an aptamer against a mushroom target. Aptamer applications can be roughly grouped into sensing, therapeutic, reagent production, and engineering categories. Sensing applications are important in environmental, biomedical, epidemiological, biosecurity, and basic research applications, where aptamers act as probes in assays, imaging methods, diagnostic assays, and biosensors. In therapeutic applications and precision medicine, aptamers can function as drugs, as targeted drug delivery vehicles, as controlled release mechanisms, and as reagents for drug discovery via high throughput screening for small molecules and proteins. Aptamers have application for protein production monitoring, quality control, and purification. They can function in molecular engineering applications as a way to modify proteins, such as enhancing DNA polymerase to make PCR more reliable. Because the affinity of the aptamer also affects its dynamic range and limit of detection, aptamers with a lower affinity may be desirable when assaying high concentrations of a target molecule. Affinity chromatography also depends on the ability of the affinity reagent, such as an aptamer, to bind and release its target, and lower affinities may aid in the release of the target molecule. Hence, specific applications determine the useful range for aptamer affinity.

Замена антитела

Аптамеры могут заменить антитела во многих биотехнологических приложениях, таких как вестерн-блоттинг, иммуногистохимия (IHC) и проточная цитометрия. В качестве терапевтических средств они могут выступать в роли агонистов или антагонистов своего лиганда. Если антитела – это хорошо известная технология с развитым рынком, то аптамеры – относительно новая технология для большинства исследователей, и аптамеры созданы лишь против небольшой доли важных исследовательских мишеней. В отличие от антител, немодифицированные аптамеры более подвержены деградации нуклеазами в сыворотке и почечной экскреции in vivo. Аптамеры значительно меньше антител по размеру и массе, что может быть важным фактором при выборе оптимального решения для конкретной задачи. Когда аптамеры доступны для определенного применения, их преимущества перед антителами включают потенциально более низкую иммуногенность, лучшую воспроизводимость и более низкую стоимость, более высокий уровень контроля благодаря условиям отбора in vitro, а также возможность эффективной модификации для повышения стабильности, специфичности и чувствительности. Кроме того, аптамеры способствуют сокращению использования лабораторных животных. В то время как для первоначального открытия и, в случае поликлональных антител, для производства антител часто требуется использование животных, отбор и производство аптамеров обычно не связаны с использованием животных. Однако методы фагового дисплея позволяют осуществлять отбор антител in vitro с последующим производством из моноклональной клеточной линии, полностью исключая использование животных.

Контролируемое высвобождение терапевтических средств

Способность аптамеров обратимо связывать молекулы, такие как белки, вызывает все больший интерес к их использованию для обеспечения контролируемого высвобождения терапевтических биомолекул, таких как факторы роста. Этого можно достичь путем регулирования прочности связывания для пассивного высвобождения факторов роста, а также активного высвобождения посредством таких механизмов, как гибридизация аптамера с комплементарными олигонуклеотидами или конформационное изменение аптамера под действием клеточных сил натяжения.

AptaBiD

AptaBiD (Aptamer Facilitated Biomarker Discovery) — это метод обнаружения биомаркеров на основе аптамеров.

Пептидные аптамары

В то время как большинство аптамеров основаны на ДНК, РНК или XNA, пептидные аптамеры — это искусственные белки, отобранные или сконструированные для связывания с конкретными целевыми молекулами.

Структура

Пептидные аптамеры состоят из одной или нескольких пептидных петель с переменной последовательностью, представленных белковым каркасом. Производные, известные как "головастики", в которых "головки" пептидных аптамеров ковалентно связаны с уникальными последовательностями двухцепочечной ДНК "хвостов", позволяют количественно определять редкие целевые молекулы в смесях посредством ПЦР (например, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени) их ДНК-хвостов. Пептиды, формирующие переменные области аптамера, синтезируются как часть той же полипептидной цепи, что и каркас, и фиксированы на своих N- и C-концах связью с ним. Это двойное структурное ограничение уменьшает разнообразие трехмерных структур, которые могут принимать переменные области, а это снижение структурного разнообразия уменьшает энтропийную стоимость молекулярного связывания, когда взаимодействие с мишенью приводит к тому, что переменные области принимают единую структуру.

Выбор

Наиболее распространенной системой отбора пептидных аптамеров является система двух гибридов дрожжей. Пептидные аптамеры также могут быть отобраны из комбинаторных пептидных библиотек, созданных с помощью фагового дисплея и других технологий поверхностного отображения, таких как дисплей мРНК, рибосомный дисплей, бактериальный дисплей и дисплей дрожжей. Эти экспериментальные процедуры также известны как биопаннинг. Все пептиды, отобранные в ходе скрининга комбинаторных пептидных библиотек, хранятся в базе данных MimoDB.

Приложения

Библиотеки пептидных аптамеров использовались в качестве "мутагенов" в исследованиях, где исследователь вводит библиотеку, экспрессирующую различные пептидные аптамеры, в популяцию клеток, отбирает клетки с желаемым фенотипом и идентифицирует аптамеры, вызывающие этот фенотип. Затем исследователь использует эти аптамеры в качестве приманок, например, в двухгибридных скринингах на дрожжах, для идентификации клеточных белков, являющихся мишенями этих аптамеров. Такие эксперименты позволяют идентифицировать конкретные белки, связываемые аптамерами, и белковые взаимодействия, которые аптамеры нарушают, приводя к изменению фенотипа. Кроме того, пептидные аптамеры, модифицированные соответствующими функциональными группами, могут вызывать специфическую посттрансляционную модификацию их целевых белков или изменять субклеточное распределение этих белков.

Промышленность и научное сообщество

Коммерческие продукты и компании, созданные на основе аптамеров, включают препарат Macugen (пегаптаниб) и клинико-диагностическую компанию SomaLogic. Международное общество по изучению аптамеров (INSOAP), профессиональное сообщество исследователей в области аптамеров, публикует журнал, посвященный этой теме, – Aptamers. Apta index – это актуальная база данных, содержащая каталог и упрощающая процесс заказа более 700 аптамеров.