Двухгибридный скрининг: метод выявления белок-белковых взаимодействий.

Введение

Техника молекулярной биологии

Двухгибридный скрининг (первоначально известный как система двухгибридных дрожжей или Y2H) — это метод молекулярной биологии, используемый для выявления белок-белковых взаимодействий (PPI) и взаимодействий белок-ДНК путем тестирования на физические взаимодействия (например, связывание) между двумя белками или одним белком и молекулой ДНК соответственно. В основе метода лежит активация нижележащих репортерных генов при связывании фактора транскрипции с восходящей активирующей последовательностью (UAS). Для двухгибридного скрининга фактор транскрипции разделяют на два отдельных фрагмента, называемых ДНК-связывающим доменом (DBD или часто также сокращенно BD) и активирующим доменом (AD). BD отвечает за связывание с UAS, а AD — за активацию транскрипции. С тех пор тот же принцип был адаптирован для описания многих альтернативных методов, включая те, которые выявляют взаимодействия белок-ДНК или ДНК-ДНК, а также методы, использующие различные организмы-хозяева, такие как Escherichia coli или клетки млекопитающих, вместо дрожжей.

Основная предпосылка

Ключ к технологии двух гибридов заключается в том, что у большинства факторов транскрипции эукариот активирующие и связывающие домены являются модульными и могут функционировать в непосредственной близости друг от друга без прямого связывания. Это означает, что даже если фактор транскрипции разделен на два фрагмента, он все равно способен активировать транскрипцию при их косвенном соединении. Наиболее распространенным методом скрининга является двухгибридный анализ на дрожжах. В этом подходе исследователь знает местоположение каждой "добычи" (prey) на используемой среде (агарных пластинках). За последнее десятилетие миллионы потенциальных взаимодействий в различных организмах были проанализированы с использованием высокопроизводительных систем скрининга (часто с применением роботов), и более тысячи взаимодействий были обнаружены и каталогизированы в базах данных, таких как BioGRID. Эта система часто использует генетически модифицированный штамм дрожжей, в котором отсутствует биосинтез определенных питательных веществ (обычно аминокислот или нуклеиновых кислот). При культивировании на среде, лишенной этих питательных веществ, дрожжи не выживают. Этот мутантный штамм дрожжей может быть трансформирован чужеродной ДНК в форме плазмид. При двухгибридном скрининге на дрожжах отдельные плазмиды, содержащие "приманку" (bait) и "добычу", одновременно вводятся в мутантный штамм дрожжей, либо используется стратегия слияния клеток для получения обоих плазмид в одной клетке-хозяине. Гибридные экспрессионные фагемиды могут быть электропорированы в клетки *E. coli* XL1 Blue, которые после амплификации и заражения вспомогательным фагом VCS M13 дадут запас фаговой библиотеки. Каждый из этих фагов будет содержать один единственный представитель библиотеки фагемидов. В системе разделенного убиквитина два интегральных мембранных белка, подлежащих исследованию, сливаются с двумя различными фрагментами убиквитина: C-концевым фрагментом ("Cub", остатки 35–76) и N-концевым фрагментом ("Nub", остатки 1–34). Эти слитые белки соответственно называются "приманкой" и "добычей". Помимо слияния с интегральным мембранным белком, фрагмент Cub также сливается с фактором транскрипции (TF), который может быть отщеплен убиквитин-специфическими протеазами. При взаимодействии "приманки" и "добычи" фрагменты Nub и Cub собираются, восстанавливая разделенный убиквитин. Реконструированная молекула разделенного убиквитина распознается убиквитин-специфическими протеазами, которые отщепляют фактор транскрипции, позволяя ему индуцировать транскрипцию репортерных генов.

The key to the two hybrid screen is that in most eukaryotic transcription factors, the activating and binding domains are modular and can function in proximity to each other without direct binding. This means that even though the transcription factor is split into two fragments, it can still activate transcription when the two fragments are indirectly connected. The most common screening approach is the yeast two hybrid assay. In this approach the researcher knows where each prey is located on the used medium (agar plates). Millions of potential interactions in several organisms have been screened in the latest decade using high throughput screening systems (often using robots) and over thousands of interactions have been detected and categorized in databases as BioGRID. This system often utilizes a genetically engineered strain of yeast in which the biosynthesis of certain nutrients (usually amino acids or nucleic acids) is lacking. When grown on media that lacks these nutrients, the yeast fail to survive. This mutant yeast strain can be made to incorporate foreign DNA in the form of plasmids. In yeast two hybrid screening, separate bait and prey plasmids are simultaneously introduced into the mutant yeast strain or a mating strategy is used to get both plasmids in one host cell. The hybrid expression phagemids can be electroporated into E. coli XL 1 Blue cells which after amplification and infection with VCS M13 helper phage, will yield a stock of library phage. These phage will each contain one single stranded member of the phagemid library. In the split ubiquitin system, two integral membrane proteins to be studied are fused to two different ubiquitin moieties: a C terminal ubiquitin moiety ("Cub", residues 35–76) and an N terminal ubiquitin moiety ("Nub", residues 1–34). These fused proteins are called the bait and prey, respectively. In addition to being fused to an integral membrane protein, the Cub moiety is also fused to a transcription factor (TF) that can be cleaved off by ubiquitin specific proteases. Upon bait–prey interaction, Nub and Cub moieties assemble, reconstituting the split ubiquitin. The reconstituted split ubiquitin molecule is recognized by ubiquitin specific proteases, which cleave off the transcription factor, allowing it to induce the transcription of reporter genes.

Флуоресцентный анализ двух гибридов

Золгадр и его коллеги представили флуоресцентную систему двух гибридов, использующую два гибридных белка, слитых с различными флуоресцентными белками, а также LacI, лаковый репрессор. Структура этих гибридных белков выглядит следующим образом: FP2 LacI-приманка и FP1-партнер, где белки-приманка и партнеры взаимодействуют, сближая флуоресцентные белки (FP1 = GFP, FP2 = mCherry) в непосредственной близости от сайта связывания белка LacI в геноме клетки-хозяина. Система также может быть использована для поиска ингибиторов белок-белковых взаимодействий.

Энзиматические двугибридные системы: KISS

В то время как первоначальная система Y2H использовала реконструированный транскрипционный фактор, другие системы создают ферментативную активность для обнаружения белок-белковых взаимодействий (ББВ). Например, KInase Substrate Sensor ("KISS") – это двухгибридный подход, разработанный для картирования внутриклеточных ББВ. В этой системе белок-приманка сливается с киназной частью TYK2, а белок-партнер соединяется с фрагментом цитокинового рецептора gp130. При взаимодействии приманки и партнера, TYK2 фосфорилирует докинг-сайты STAT3 на химерном белке-партнере, что в конечном итоге приводит к активации репортерного гена.

Одногибридный

Один гибридный вариант этой техники разработан для изучения взаимодействий белок-ДНК и использует единый белок-слияние, в котором активирующий домен (АД) напрямую связан со связывающим доменом. Однако в этом случае связывающий домен не обязательно имеет фиксированную последовательность, как в двухгибридном анализе белок-белок, а может быть представлен библиотекой. Эта библиотека может быть отобрана по отношению к желаемой целевой последовательности, которая вставляется в промоторную область конструкции гена-репортера. В системе положительного отбора таким образом отбирается связывающий домен, который успешно связывается с UAS и обеспечивает транскрипцию. Клетки дрожжей часто не имеют тех же посттрансляционных модификаций, используют другие кодоны или лишены определенных белков, важных для корректной экспрессии белков. Для преодоления этих проблем разработано несколько новых двухгибридных систем. В зависимости от используемой системы для культивирования клеток и отбора взаимодействующих используются агарные пластинки или специализированная среда для роста. Наиболее распространенным методом является высев на агар, когда клетки высеваются на селективную среду для определения наличия взаимодействия. Клетки, не содержащие взаимодействующих белков, не должны выживать на этой селективной среде.

S. cerevisiae (закваска)

Дрожжи S. cerevisiae были модельным организмом, использованным при разработке метода двух гибридов. Он обычно известен как система Y2H. Этот организм обладает рядом характеристик, делающих его надежной платформой для изучения взаимодействий, включая способность формировать третичные белковые структуры, нейтральный внутренний pH, повышенную способность к образованию дисульфидных связей и восстановленный глутатион, а также другие цитозольные буферные факторы, поддерживающие благоприятную внутриклеточную среду. Также использовались штаммы дрожжей AH109, R2HMet и BK100, все произведены компанией Clontech.

Candida albicans (обычно в виде

C. albicans – это дрожжи, обладающие уникальной особенностью: они транслируют кодон CUG в серин, а не в лейцин. Из-за этого отличия в использовании кодонов затруднительно использовать модельную систему S. cerevisiae в качестве системы Y2H для проверки белок-белковых взаимодействий, используя гены C. albicans. Для создания более естественной среды была разработана двухгибридная система C. albicans (C2H). Эта система позволяет изучать белок-белковые взаимодействия непосредственно в C. albicans. Недавно была создана система с высокой пропускной способностью.

Э. коли

Бактериальные двухгибридные методы (B2H или BTH) обычно проводятся в *E. coli* и имеют ряд преимуществ по сравнению с системами на основе дрожжей. Например, более высокая эффективность трансформации и более быстрый темп роста позволяют использовать более крупные библиотеки (свыше 10⁸). В данной системе для выявления белок-белковых взаимодействий используются транзиторно трансфицированные клетки млекопитающих. Использование клеточной линии млекопитающих для изучения белок-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих дает преимущество работы в более естественных условиях. Кроме того, в двухгибридной системе на клетках млекопитающих можно изучать сигнальные пути. Еще одним значительным преимуществом является возможность получения результатов в течение 48 часов после трансфекции.

Аплисия калифорника

Морской заяц A californica является модельной системой в нейробиологии для изучения, в частности, молекулярных механизмов долговременной памяти. Для изучения взаимодействий, важных для неврологии, в более нативной среде была разработана двухгибридная система в нейронах A californica. В этой системе используются GAL4 AD и BD.

Бомбикс мори

Система двух гибридов (I2H) была разработана на клеточной линии шелкопряда, полученной из личинки или гусеницы домашнего шелкопряда Bombyx mori (клетки BmN4). В этой системе используются GAL4 BD и активирующая область мышиного NF κB P65, оба под контролем промотора OpIE2.

Определение последовательностей, имеющих решающее значение для взаимодействия

Изменение специфических аминокислот путем мутации соответствующих пар оснований ДНК в используемых плазмидах позволяет определить важность этих аминокислотных остатков для поддержания взаимодействия. Используя ген отбора с желаемой целевой последовательностью, включенной в UAS, и рандомизируя соответствующие последовательности аминокислот для создания библиотеки ZFP, можно отобрать клетки, в которых происходит взаимодействие ДНК ZFP с необходимыми характеристиками. Поскольку каждый ZFP обычно распознает только 3–4 пары оснований, для предотвращения распознавания сайтов вне UAS рандомизированный ZFP конструируется в виде "каркаса", состоящего из двух других ZFP с постоянной последовательностью. Таким образом, UAS разрабатывается таким образом, чтобы включать целевую последовательность постоянного каркаса в дополнение к последовательности, для которой отбирается ZFP, или с использованием биоинформатических методов. Последние позволяют проверить, экспрессируются ли взаимодействующие белки одновременно, обладают ли они общими характеристиками (например, аннотациями генной онтологии или определенными сетевыми топологиями), или имеют ли гомологичные взаимодействия у других видов.