Субклонирование в молекулярной биологии: перемещение ДНК-фрагментов между векторами. Использование рестриктаз, очистка гена для вставки, гель-электрофорез.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
В молекулярной биологии субклонирование — это техника, используемая для переноса конкретной последовательности ДНК из исходного вектора в вектор-реципиент. Субклонирование не следует путать с молекулярным клонированием, являющимся схожей техникой.
In molecular biology, subcloning is a technique used to move a particular DNA sequence from a parent vector to a destination vector. Subcloning is not to be confused with molecular cloning, a related technique.
Процедура
Ограничительные ферменты используются для вырезания интересующего гена (вставки) из исходной ДНК. Вставка очищается для изоляции от других молекул ДНК. Распространенным методом очистки является выделение из геля. Затем количество копий гена амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одновременно те же самые ограничительные ферменты используются для расщепления (разрезания) вектора-реципиента. Идея использования одних и тех же ферментов ограничения заключается в создании комплементарных липких концов, которые облегчат последующую лигацию. Для предотвращения самолигирования вектора-реципиента также добавляется фосфатаза, обычно кишечная щелочная фосфатаза (CIAP). Расщепленный вектор-реципиент изолируется/очищается. Затем вставка и вектор-реципиент смешиваются с ДНК-лигазой. Типичное молярное соотношение вставляемого гена к вектору-реципиенту составляет 3:1; увеличение концентрации вставки дополнительно снижает вероятность самолигирования. После выдерживания реакционной смеси в течение определенного времени при определенной температуре (зависящей от размера лигируемых фрагментов; подробнее см. в описании ДНК-лигазы), вставка должна успешно встроиться в плазмиду-реципиент.
Restriction enzymes are used to excise the gene of interest (the insert) from the parent. The insert is purified in order to isolate it from other DNA molecules. A common purification method is gel isolation. The number of copies of the gene is then amplified using polymerase chain reaction (PCR). Simultaneously, the same restriction enzymes are used to digest (cut) the destination. The idea behind using the same restriction enzymes is to create complementary sticky ends, which will facilitate ligation later on. A phosphatase, commonly calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP), is also added to prevent self ligation of the destination vector. The digested destination vector is isolated/purified. The insert and the destination vector are then mixed together with DNA ligase. A typical molar ratio of insert genes to destination vectors is 3:1; by increasing the insert concentration, self ligation is further decreased. After letting the reaction mixture sit for a set amount of time at a specific temperature (dependent upon the size of the strands being ligated; for more information see DNA ligase), the insert should become successfully incorporated into the destination plasmid.
Амплификация плазмида продукта
Плазмида часто вводится в бактерию, например, E. coli. В идеале, при делении бактерии плазмида также должна реплицироваться. В оптимальном случае каждая бактериальная клетка должна содержать несколько копий плазмиды. После того как вырастет достаточное количество бактериальных колоний, их можно подвергнуть мини-выделению для получения плазмидной ДНК.
The plasmid is often transformed into a bacterium like E. coli. Ideally when the bacterium divides the plasmid should also be replicated. In the best case scenario, each bacterial cell should have several copies of the plasmid. After a good number of bacterial colonies have grown, they can be miniprepped to harvest the plasmid DNA.
Выбор
Для обеспечения роста только трансформированных бактерий (которые несут желаемые плазмиды для последующего выделения), в целевом векторе используется маркерный ген для селекции. Типичные маркерные гены кодируют устойчивость к антибиотикам или способность к биосинтезу питательных веществ. Например, "маркерный ген" может обеспечивать устойчивость к антибиотику ампициллину. Если бактерии, которым предназначалось поглотить желаемую плазмиду, действительно поглотили ее, то они также будут содержать "маркерный ген". Таким образом, бактерии, поглотившие плазмиду, смогут расти в среде с ампициллином, а бактерии, не поглотившие плазмиду, останутся чувствительными к его действию и погибнут. Следовательно, успешно трансформированные бактерии будут "отобраны".
In order to ensure growth of only transformed bacteria (which carry the desired plasmids to be harvested), a marker gene is used in the destination vector for selection. Typical marker genes are for antibiotic resistance or nutrient biosynthesis. So, for example, the "marker gene" could be for resistance to the antibiotic ampicillin. If the bacteria that were supposed to pick up the desired plasmid had picked up the desired gene then they would also contain the "marker gene". Now the bacteria that picked up the plasmid would be able to grow in ampicillin whereas the bacteria that did not pick up the desired plasmid would still be vulnerable to destruction by the ampicillin. Therefore, successfully transformed bacteria would be "selected."
Пример: субклонирование плазмиды бактерий
В этом примере ген из библиотеки генов млекопитающих будет субклонирован в бактериальную плазмиду (платформу-реципиент). Бактериальная плазмида – это кольцевая молекула ДНК, содержащая регуляторные элементы, позволяющие бактериям производить генный продукт (экспрессию гена), если он вставлен в нужное место в плазмиде. Участок для вставки фланкирован двумя сайтами рестрикции "А" и "Б" с несовместимыми липкими концами. В ДНК млекопитающих этих сайтов рестрикции нет, поэтому они добавляются с помощью ПЦР с расширением перекрывающихся праймеров. Праймеры разрабатываются таким образом, чтобы сайты рестрикции были расположены точно, чтобы кодирующая последовательность белка находилась в открытой рамке чтения, и чтобы по обе стороны от белка было добавлено минимальное количество дополнительных аминокислот. И продукт ПЦР, содержащий ген млекопитающих с новыми сайтами рестрикции, и плазмида-реципиент подвергаются рестрикционному перевариванию, а продукты переваривания очищаются с помощью электрофореза в геле. Продукты переваривания, теперь имеющие совместимые липкие концы друг с другом (но несовместимые с собственными липкими концами), подвергаются лигированию, в результате чего образуется новая плазмида, содержащая основные элементы исходной плазмиды с новой вставкой. Плазмида трансформируется в бактерии, и идентичность вставки подтверждается секвенированием ДНК.
In this example, a gene from mammalian gene library will be subcloned into a bacterial plasmid (destination platform). The bacterial plasmid is a piece of circular DNA which contains regulatory elements allowing for the bacteria to produce a gene product (gene expression) if it is placed in the correct place in the plasmid. The production site is flanked by two restriction enzyme cutting sites "A" and "B" with incompatible sticky ends. The mammalian DNA does not come with these restriction sites, so they are built in by overlap extension PCR. The primers are designed to put the restriction sites carefully, so that the coding of the protein is in frame, and a minimum of extra amino acids is implanted on either side of the protein. Both the PCR product containing the mammalian gene with the new restriction sites and the destination plasmid are subjected to restriction digestion, and the digest products are purified by gel electrophoresis. The digest products, now containing compatible sticky ends with each other (but incompatible sticky ends with themselves) are subjected to ligation, creating a new plasmid which contains the background elements of the original plasmid with a different insert. The plasmid is transformed into bacteria and the identity of the insert is confirmed by DNA sequencing.