Альфавирусы: структура, геном и механизмы проникновения в клетку.

Введение

Род вирусов

Альфавирус – это род РНК-вирусов, единственный род в семействе Togaviridae. Альфавирусы относятся к группе IV классификации вирусов по Балтимору, характеризуясь геномом из одноцепочечной РНК с положительной полярностью. Существует 32 вида альфавирусов, которые инфицируют различных позвоночных животных, таких как люди, грызуны, рыбы, птицы и крупных млекопитающих, например лошадей, а также беспозвоночных. Альфавирусы, способные инфицировать как позвоночных, так и членистоногих, называют альфавирусами с двойным кругом хозяев, в то время как альфавирусы, специфичные для насекомых, такие как вирус Эйлата и вирус Яда-Яда, ограничены своими компетентными переносчиками – членистоногими. Передача между видами и особями происходит главным образом через комаров, что относит альфавирусы к группе арбовирусов – вирусов, переносимых членистоногими. Вирусные частицы альфавируса имеют оболочку, диаметр 70 нм, обычно сферическую форму (хотя и слегка плеоморфную) и изометрический нуклеокапсид размером 40 нм.

Геном

Альфавирусы — это небольшие, сферические, заключенные в оболочку вирусы с геномом, состоящим из одноцепочечной позитивной РНК. Общая длина генома варьируется от 11 000 до 12 000 нуклеотидов и имеет 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост. Четыре гена неструктурных белков кодируются в 5'-двух третях генома, в то время как три структурных белка транслируются из субгеномной мРНК, колинеарной с 3'-одной третью генома. В геноме присутствуют две открытые рамки считывания (ОРФ) – неструктурная и структурная. Первая является неструктурной и кодирует белки (nsP1–nsP4), необходимые для транскрипции и репликации вирусной РНК. Вторая кодирует три структурных белка: белок капсида C и белки оболочки P62 и E1, которые ассоциируют в гетеродимер. Поверхностные гликопротеины, закрепленные в вирусной мембране, отвечают за распознавание рецепторов и проникновение в клетки-мишени посредством слияния мембран.

Структурные белки

Протеолитическое созревание P62 в E2 и E3 приводит к изменению вирусной поверхности. Вместе гликопротеины E1, E2 и иногда E3 формируют димер E1/E2 или тример E1/E2/E3, где E2 простирается от центра к вершинам, E1 заполняет пространство между вершинами, а E3, если присутствует, находится на дистальном конце "колючки". При контакте вируса с кислой средой эндосомы, E1 диссоциирует от E2, образуя гомотример E1, который необходим для этапа слияния, обеспечивающего объединение клеточной и вирусной мембран. Альфавирусный гликопротеин E1 является вирусным белком слияния класса II, структурно отличающимся от белков слияния класса I, обнаруженных в вирусе гриппа и ВИЧ. Структура вируса леса Семилика оказалась сходной со структурой флавивирусного гликопротеина E, имеющего три структурных домена в одинаковом расположении первичной последовательности. Гликопротеин E2 взаимодействует с нуклеокапсидом посредством своего цитоплазматического домена, а его эктодомен отвечает за связывание с клеточным рецептором. Большинство альфавирусов теряют периферический белок E3, однако у вирусов Semliki он остается ассоциированным с вирусной поверхностью.

Неструктурные белки

Четыре неструктурных белка (nsP1–4), которые образуются в виде единого полипротеина, составляют репликационный аппарат вируса. Обработка полипротеина происходит строго регулируемым образом, при этом расщепление в стыке P2/3 влияет на использование матричной РНК во время репликации генома. Этот участок расположен у основания узкой щели и не является легкодоступным. Перед расщеплением nsP3 формирует кольцевую структуру, охватывающую nsP2. Эти два белка имеют обширный интерфейс. Мутации в nsP2, приводящие к образованию невироцидных вирусов или температурно-чувствительных фенотипов, локализуются в области интерфейса P2/P3. Мутации в P3, расположенные напротив невироцидных мутаций в nsP2, препятствуют эффективному расщеплению P2/3. Это, в свою очередь, влияет на инфекционность РНК, изменяя уровни продукции вирусной РНК.

Вирусология

Вирус имеет диаметр 60–70 нанометров. Он заключен в оболочку, имеет сферическую форму и содержит одноцепочечный позитивный РНК-геном размером около 12 килобаз. Геном кодирует два полипротеина. Первый полипротеин состоит из четырех неструктурных единиц: в порядке от N-конца до C-конца – nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4. Второй – структурный полипротеин, состоящий из пяти экспрессионных единиц: от N-конца до C-конца – капсид, E3, E2, 6K и E1. Субгеномная позитивная нить РНК, РНК 26S, реплицируется из промежуточной одноцепочечной негативной РНК. Она служит матрицей для синтеза структурных белков вируса. Большинство альфавирусов содержат консервативные домены, участвующие в регуляции синтеза вирусной РНК. Нуклеокапсид диаметром 40 нанометров содержит 240 копий белка капсида и имеет икосаэдрическую симметрию T = 4. Вирусные гликопротеины E1 и E2 встроены в липидный бислой. Отдельные молекулы E1 и E2 ассоциируют, образуя гетеродимеры. Гетеродимеры E1–E2 образуют контакты типа «один к одному» между белком E2 и мономерами нуклеокапсида. Белки E1 и E2 опосредуют контакт между вирусом и клеткой-хозяином. Было идентифицировано несколько рецепторов, включая прогибитин, фосфатидилсерин, гликозаминогликаны и β-субъединицу АТФ-синтазы (требуется ссылка). Репликация происходит в цитоплазме, в частности, в областях, называемых «сферулами», отделенных от остальной части клетки инвагинациями плазматической мембраны. Каждый комплекс занимает одну такую область диаметром около 50 нм. Вирионы созревают путем почкования через плазматическую мембрану, где ассимилируются кодируемые вирусом поверхностные гликопротеины E2 и E1. Эти два гликопротеина являются мишенями для многочисленных серологических реакций и тестов, включая нейтрализацию и ингибирование гемагглютинации. Альфавирусы демонстрируют различную степень антигенного перекрестного реагирования в этих реакциях, что является основой для семи антигенных комплексов, 32 видов и многих подтипов и вариантов. Белок E2 содержит большинство нейтрализующих эпитопов, в то время как белок E1 содержит больше консервативных, перекрестно-реагирующих эпитопов.

The virus has a 60–70 nanometer diameter. It is enveloped, spherical and has a positive strand RNA genome of ~12 kilobases. The genome encodes two polyproteins. The first polyprotein consists of four non structural units: in order from the N terminal to the C terminal nsP1, nsP2, nsP3, and nsP4. The second is a structural polyprotein composed of five expression units: from the N terminal to the C terminal Capsid, E3, E2, 6K and E1. A sub genomic positive strand RNA the 26S RNA is replicated from a negative stranded RNA intermediate. This serves as template for the synthesis of viral structural proteins. Most alphaviruses have conserved domains involved in regulation of viral RNA synthesis. The nucleocapsid, 40 nanometers in diameter, contains 240 copies of the capsid protein and has a T = 4 icosahedral symmetry. The E1 and E2 viral glycoproteins are embedded in the lipid bilayer. Single E1 and E2 molecules associate to form heterodimers. The E1–E2 heterodimers form one to one contacts between the E2 protein and the nucleocapsid monomers. The E1 and E2 proteins mediate contact between the virus and the host cell. Several receptors have been identified. These include prohibitin, phosphatidylserine, glycosaminoglycans and ATP synthase β subunit (ref needed). Replication occurs within the cytoplasm, specifically in areas termed "spherules" separated by plasma membrane invaginations from the rest. Each complex occupies one such area of about 50 nm in inner diameter. Virions mature by budding through the plasma membrane, where virus encoded surface glycoproteins E2 and E1 are assimilated. These two glycoproteins are the targets of numerous serologic reactions and tests including neutralization and hemagglutination inhibition. The alphaviruses show various degrees of antigenic cross reactivity in these reactions and this forms the basis for the seven antigenic complexes, 32 species and many subtypes and varieties. The E2 protein is the site of most neutralizing epitopes, while the E1 protein contains more conserved, cross reactive epitopes.

Эволюция

Исследование этого таксона указывает на морское происхождение этой группы вирусов — в частности, Южного океана — и на их последующее распространение как в Старом, так и в Новом Свете. В этом роде выделяют три подгруппы: подгруппа вирусов Семиликского леса (Semliki Forest, O'nyong nyong и Ross River); подгруппа вирусов восточного энцефалита лошадей (восточный энцефалит лошадей и венесуэльский энцефалит лошадей) и подгруппа вирусов Синдиса. Вирус Синдиса, географически ограниченный Старым Светом, имеет более тесную родственную связь с подгруппой вирусов восточного энцефалита лошадей, которые являются вирусами Нового Света, чем с подгруппой вирусов Семиликского леса, также встречающейся в Старом Свете.

Диагностика, профилактика и контроль

Диагноз ставится на основе клинических образцов, из которых вирус можно легко выделить и идентифицировать. В настоящее время вакцин против альфавирусов не существует. Основными профилактическими мерами являются контроль за переносчиками с использованием репеллентов, ношение защитной одежды, уничтожение мест размножения и обработка инсектицидами.

Исследования

Альфавирусы представляют интерес для исследователей генной терапии, в частности, вирус реки Росс, вирус Синдбис, вирус леса Семилик и вирус венесуэльского энцефалита лошадей использовались для разработки вирусных векторов для доставки генов. Особый интерес представляют химерные вирусы, которые могут формироваться с альфавирусными оболочками и ретровирусными капсидами. Такие химеры называются псевдотипированными вирусами. Альфавирусные псевдотипы ретровирусов или лентивирусов способны интегрировать гены, которые они переносят, в широкий спектр потенциальных клеток-хозяев, распознаваемых и инфицируемых альфавирусными белками оболочки E2 и E1. Стабильная интеграция вирусных генов обеспечивается ретровирусными компонентами этих векторов. Существуют ограничения в использовании альфавирусов в генной терапии из-за отсутствия специфичности нацеливания, однако, путем введения вариабельных доменов антител в некорсервативную петлю структуры E2, удалось нацелить на конкретные популяции клеток. Кроме того, использование целых альфавирусов для генной терапии имеет ограниченную эффективность, как из-за участия нескольких внутренних альфавирусных белков в индукции апоптоза при инфекции, так и из-за того, что альфавирусный капсид обеспечивает лишь временное введение мРНК в клетки-хозяева. Ни одно из этих ограничений не распространяется на альфавирусные псевдотипы ретровирусов или лентивирусов. Однако экспрессия оболочек вируса Синдбис может приводить к апоптозу, и их введение в клетки-хозяева при заражении ретровирусами, псевдотипированными оболочкой вируса Синдбис, также может вызывать гибель клеток. Токсичность вирусных оболочек Синдбис может быть причиной очень низких титров продукции, получаемых из упаковочных клеток, сконструированных для производства псевдотипов Синдбис. Другое направление исследований, связанное с альфавирусами, – это вакцинация. Альфавирусы можно модифицировать для создания репликонных векторов, эффективно индуцирующих гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ. Следовательно, их можно использовать для вакцинации против вирусных, бактериальных, простейших и опухолевых антигенов.

Alphaviruses are of interest to gene therapy researchers, in particular the Ross River virus, Sindbis virus, Semliki Forest virus, and Venezuelan equine encephalitis virus have all been used to develop viral vectors for gene delivery. Of particular interest are the chimeric viruses that may be formed with alphaviral envelopes and retroviral capsids. Such chimeras are termed pseudotyped viruses. Alphaviral envelope pseudotypes of retroviruses or lentiviruses are able to integrate the genes that they carry into the expansive range of potential host cells that are recognized and infected by the alphaviral envelope proteins E2 and E1. The stable integration of viral genes is mediated by the retroviral interiors of these vectors. There are limitations to the use of alphaviruses in the field of gene therapy due to their lack of targeting, however, through the introduction of variable antibody domains in a non conserved loop in the structure of E2, specific populations of cells have been targeted. Furthermore, the use of whole alphaviruses for gene therapy is of limited efficacy both because several internal alphaviral proteins are involved in the induction of apoptosis upon infection and also because the alphaviral capsid mediates only the transient introduction of mRNA into host cells. Neither of these limitations extend to alphaviral envelope pseudotypes of retroviruses or lentiviruses. However, the expression of Sindbis virus envelopes may lead to apoptosis, and their introduction into host cells upon infection by Sindbis virus envelope pseudotyped retroviruses may also lead to cell death. The toxicity of Sindbis viral envelopes may be the cause of the very low production titers realized from packaging cells constructed to produce Sindbis pseudotypes. Another branch of research involving alphaviruses is in vaccination. Alphaviruses are apt to be engineered to create replicon vectors which efficiently induce humoral and T cell immune responses. They could therefore be used to vaccinate against viral, bacterial, protozoan, and tumor antigens.