Введение

Бактериофаг, инфицирующий Escherichia coli.

Enterobacteria phage λ (lambda phage, coliphage λ, официально Escherichia virus Lambda) — бактериальный вирус, или бактериофаг, инфицирующий бактериальный вид Escherichia coli (E. coli). Он был открыт Эстер Ледерберг в 1950 году. Дикий тип этого вируса имеет умеренный жизненный цикл, позволяющий ему либо существовать в геноме хозяина посредством лизогении, либо переходить в литическую фазу, во время которой он убивает и лизирует клетку для размножения. Штаммы ламбды, мутировавшие в определенных участках, не способны лизогенизировать клетки; вместо этого они растут и переходят в литический цикл после суперинфекции уже лизогенизированной клетки. Фаговая частица состоит из головки (также известной как капсид), хвоста и хвостовых волокон (см. изображение вируса ниже). В головке содержится двунитевая линейная ДНК-геном фага. Во время инфекции фаговая частица распознает и связывается со своим хозяином, E. coli, что приводит к выбросу ДНК из головки фага через хвост в цитоплазму бактериальной клетки. Обычно запускается «литический цикл», в ходе которого ДНК ламбды реплицируется и в клетке образуются новые фаговые частицы. Затем происходит лизис клетки, высвобождающий содержимое клетки, включая собранные вирионы, в окружающую среду. Однако при определенных условиях ДНК фага может интегрироваться в хромосому клетки-хозяина по лизогенному пути. В этом состоянии ДНК λ называется профагом и остается в геноме хозяина, не причиняя ему видимого вреда. Клетка-хозяин, содержащая профаг, называется лизогеном. Этот профаг может перейти в литический цикл, когда лизоген попадает в стрессовое состояние.

Анатомия

Вирусная частица состоит из головки и хвоста, которые могут иметь хвостовые волокна. Вся частица состоит из 12–14 различных белков, содержащих более 1000 молекул белка в общей сложности, и одной молекулы ДНК, расположенной в головке фага. Однако до сих пор не совсем ясно, входят ли белки L и M в состав вириона. [[Файл:Ламбдафагический геном линейный.svg|thumb|498 px|center|Линейная схема генома ламбда-фага с основными оперонами, промоторными областями и генами, кодирующими капсид. Пары оснований двухцепочечной линейной ДНК с 12 одноцепочечными сегментами на обоих 5'-концах. Эти два одноцепочечных сегмента являются "липкими концами" так называемого cos-сайта. Cos-сайт циркуляризует ДНК в цитоплазме хозяина. Таким образом, в своей циркулярной форме геном фага имеет длину 48 502 пар оснований. Молекула порина, являющаяся частью оперона мальтозы. Линейный геном фага вводится через внешнюю мембрану. ДНК проходит через комплекс маннозо-пермеазы во внутренней мембране (кодируется генами *manXYZ*) и немедленно циркуляризуется, используя cos-сайты – 12-нуклеотидные, богатые GC сплошные "липкие концы". Одноцепочечные концы вирусной ДНК лигируются ДНК-лигазой хозяина. Обычно не принимается во внимание, что 12-нуклеотидные когезивные концы ламбда-фага были объектом первого прямого нуклеотидного секвенирования биологической ДНК. При первоначальной инфекции стабильность cII определяет жизненный цикл фага: стабильная cII приводит к лизогенному пути, а если cII деградирует, фаг переходит в литический путь. Низкая температура, дефицит питательных веществ в клетках и высокая мультиплицированность инфекции (MOI) известны как факторы, способствующие лизогении (см. дальнейшее обсуждение).

N антитерминация

Это происходит без взаимодействия N-белка с ДНК; вместо этого белок связывается с новообразованной мРНК. Участки Nut содержат 3 консервативных "блока", из которых только блок BoxB является существенным. РНК-последовательности BoxB расположены вблизи 5'-конца транскриптов pL и pR. При транскрипции каждая последовательность формирует структуру шпильки, к которой может связываться N-белок. N-белок связывается с BoxB в каждом транскрипте и контактирует с транскрибирующей РНК-полимеразой посредством петли РНК. Комплекс N-РНК-полимеразы стабилизируется последующим связыванием нескольких хозяинских белков Nus (N-утилизирующее вещество) – включающих факторы терминации/антитерминации транскрипции и, что примечательно, субъединицу рибосомы. Весь комплекс (включая связанный участок Nut на мРНК) продолжает транскрипцию и может преодолевать сигналы терминации.

Жизненный цикл литики

Это жизненный цикл, который фаг проходит после большинства инфекций, когда белок cII не достигает достаточной концентрации из-за деградации и, следовательно, не активирует свои промоторы. Продолжается транскрипция "поздних ранних" генов, включая xis, int, Q и гены, отвечающие за репликацию генома фага лямбда (OP). Cro доминирует на репрессорном сайте (см. раздел "Репрессор"), подавляя синтез с промотора PRM (который является промотором лизогенного цикла). Белки O и P инициируют репликацию фаговой хромосомы (см. "Литическая репликация"). Q, другой антитерминатор, связывается с Qut-сайтами. Транскрипция с промотора PR' теперь может продолжаться, образуя мРНК для лизиса, а также для белков головки и хвоста. Структурные белки и геномы фагов самособираются в новые фаговые частицы. Продукты генов S, R, Rz и Rz1 вызывают лизис клеток. S – это холин, небольшой мембранный белок, который в момент времени, определяемый аминокислотной последовательностью белка, внезапно образует поры в мембране. R – это эндолизин, фермент, который проникает через поры, образованные S, и расщепляет клеточную стенку. Rz и Rz1 – это мембранные белки, которые формируют комплекс, разрушающий внешнюю мембрану после того, как эндолизин разрушит клеточную стенку. Для дикого типа фага лямбда лизис происходит примерно через 50 минут после начала инфекции, высвобождая около 100 вирионов.

Перепись влево

thumb|right|300px|Диаграмма, иллюстрирующая процесс ретрорегуляции, приводящий к более высокой концентрации xis по сравнению с int. Транскрипт мРНК подвергается расщеплению бактериальной РНКазой, начиная с раскрытой шпильковой структуры в sib. Транскрипция, идущая слева направо, экспрессирует гены gam, xis, bar и int.

Мутации транскрипции влево

Считается, что транскрипция влево приводит к делеционной мутации гена *rap*, что вызывает отсутствие роста фага лямбда. Это происходит из-за того, что РНК-полимераза связывается с промоторным участком pL вместо промоторного участка pR. Транскрипция влево приводит к транскрипции генов *barI* и *barII* в левом опереоне. Бар-положительный фенотип наблюдается при отсутствии гена *rap*. Предполагается, что отсутствие роста фага лямбда обусловлено температурной чувствительностью, приводящей к ингибированию роста.

xy и int регулирование вставки и вырезания

xis и int находятся на одном и том же участке мРНК, поэтому концентрации белков xis и int производятся примерно равными. Это приводит (на начальном этапе) к вырезанию любых внедренных геномов из генома хозяина. мРНК, транскрибируемая с промотора PL, формирует стабильную вторичную структуру со шпилькой в sib-секции мРНК. Эта структура направляет 3'-конец (sib-конец) мРНК к деградации РНКазой III, что приводит к более низкой эффективной концентрации int-мРНК по сравнению с xis-мРНК (поскольку цистрон int расположен ближе к последовательности sib, чем цистрон xis к последовательности sib), в результате чего наблюдается более высокая концентрация xis, чем int. Более высокая концентрация xis по сравнению с int предотвращает как внедрение, так и вырезание геномов фагов, что является эволюционно выгодным механизмом, сохраняющим любые ранее внедренные геномы фагов (снижая конкуренцию) и предотвращающим внедрение генома фага в геном обреченного хозяина.

Лизогенный (или лизеногенный) жизненный цикл

Лизогенный жизненный цикл начинается, когда концентрация белка cI достигает достаточного уровня для активации его промоторов после небольшого числа инфекций. Продолжается синтез «поздних ранних» транскриптов, включая xis, int, Q и гены, отвечающие за репликацию генома ламбды. Стабилизированный cII способствует транскрипции с промоторов PRE, PI и Pantiq. Промотор Pantiq производит антисенсовую мРНК к матрице гена Q транскрипта промотора PR, тем самым подавляя продукцию Q. Промотор PRE производит антисенсовую мРНК к участку cro транскрипта промотора PR, снижая продукцию cro, и содержит транскрипт гена cI. Это приводит к экспрессии и включению продукции репрессоров cI. Промотор PI экспрессирует ген int, что приводит к высокой концентрации белка Int. Этот белок Int интегрирует фаговую ДНК в хромосому хозяина (см. «Интеграция профага»). Отсутствие Q предотвращает расширение рамки считывания промотора PR', поэтому литические или структурные белки не синтезируются. Повышенные уровни int (значительно выше, чем уровни xis) приводят к встраиванию генома ламбды в геном хозяина (см. схему). Продукция cI приводит к связыванию cI с сайтами OR1 и OR2 в промоторе PR, выключая экспрессию cro и других ранних генов. cI также связывается с промотором PL, выключая транскрипцию и там. Отсутствие cro оставляет сайт OR3 несвязанным, поэтому может происходить транскрипция с промотора PRM, поддерживая уровни cI. Отсутствие транскрипции с промоторов PL и PR приводит к прекращению дальнейшей продукции cII и cIII. По мере снижения концентраций cII и cIII транскрипция с промоторов Pantiq, PRE и PI перестает стимулироваться, поскольку они больше не требуются. Активными остаются только промоторы PRM и PR', первый из которых производит белок cI, а второй – короткий неактивный транскрипт. Геном остается встроенным в геном хозяина в латентном состоянии. Профаг дублируется при каждом последующем делении клетки хозяина. Гены фага, экспрессируемые в этом латентном состоянии, кодируют белки, подавляющие экспрессию других фаговых генов (таких как структурные и литические гены), чтобы предотвратить переход в литический цикл. Эти репрессивные белки разрушаются, когда клетка-хозяин подвергается стрессу, что приводит к экспрессии подавленных фаговых генов. Стресс может быть вызван голоданием, токсинами (например, антибиотиками) или другими факторами, которые могут повредить или уничтожить хозяина. В ответ на стресс активированный профаг вырезается из ДНК клетки-хозяина одним из вновь экспрессированных продуктов гена и переходит в литический путь.

Интеграция профагов

Интеграция фага λ происходит в специальном участке прикрепления в бактериальном и фаговом геномах, называемом attλ. Последовательность бактериального att-сайта называется attB, расположенным между gal- и bio-оперонами, и состоит из фрагментов B O B', в то время как комплементарная последовательность в циркулярном фаговом геноме называется attP и состоит из фрагментов P O P'. Сама интеграция представляет собой последовательный обмен (см. генетическую рекомбинацию) через структуру Холлидея и требует как фагового белка Int, так и бактериального белка IHF (фактор интеграции хозяина). И Int, и IHF связываются с attP и образуют интасому – комплекс ДНК-белка, предназначенный для сайт-специфической рекомбинации фаговой и ДНК хозяина. Исходная последовательность B O B' в результате интеграции изменяется на фаговую ДНК B O P' P O B'. ДНК фага теперь является частью генома хозяина.

Поддержание лизогенеза

упрощенное представление парадигмы интеграции/вырезания и основных задействованных генов. Лизогению поддерживает исключительно белок cI. cI подавляет транскрипцию с PL и PR, одновременно повышая и контролируя собственную экспрессию с PRM. Таким образом, это единственный белок, экспрессируемый лизогенными фагами. На изображении: лизогенные репрессоры и полимераза, связанные с OR1, привлекают OR2, что активирует PRM и подавляет PR. Это координируется операторами PL и PR. Оба оператора имеют три сайта связывания для cI: OL1, OL2 и OL3 для PL, и OR1, OR2 и OR3 для PR. cI наиболее эффективно связывается с OR1; связывание здесь ингибирует транскрипцию с PR. Поскольку cI легко димеризуется, связывание cI с OR1 значительно увеличивает сродство связывания cI с OR2, и это происходит почти сразу после связывания с OR1. Это активирует транскрипцию в противоположном направлении с PRM, поскольку N-концевой домен cI на OR2 усиливает связывание РНК-полимеразы с PRM и, следовательно, cI стимулирует собственную транскрипцию. При более высокой концентрации он также связывается с OR3, ингибируя транскрипцию с PRM, тем самым регулируя собственный уровень в петле отрицательной обратной связи. Связывание cI с оператором PL очень похоже, за исключением того, что оно не оказывает прямого влияния на транскрипцию cI. Однако, в качестве дополнительного подавления собственной экспрессии, димеры cI, связанные с OR3 и OL3, изгибают ДНК между ними, способствуя тетрамеризации. Присутствие cI обеспечивает иммунитет к суперинфекции другими фагами лямбда, поскольку он ингибирует их промоторы PL и PR.

Индукция

Транскрипционное состояние PRM и PR-промоторных областей в лизогенном состоянии по сравнению с индуцированным, ранним литическим состоянием. Классическая индукция лизогена заключалась в облучении инфицированных клеток ультрафиолетовым светом. Любая ситуация, при которой лизоген подвергается повреждению ДНК или SOS-ответ хозяина иным образом стимулируется, приводит к индукции. Клетка-хозяин, содержащая дремлющий фаговый геном, испытывает повреждение ДНК из-за высокострессовой среды и начинает SOS-ответ. RecA (клеточный белок) обнаруживает повреждение ДНК и активируется. Теперь это RecA*, высокоспецифичная копротеаза. В норме RecA* связывается с LexA (репрессором транскрипции), активируя аутопротеазную активность LexA, которая разрушает репрессор LexA, позволяя синтезировать белки восстановления ДНК. В лизогенных клетках этот ответ перехватывается, и RecA* стимулирует ауторазщепление cI. Это происходит потому, что cI имитирует структуру LexA в месте ауторазщепления. Расщепленный cI больше не может димеризоваться и теряет сродство к связыванию с ДНК. Промоторы PR и PL больше не репрессируются и включаются, и клетка возвращается к литической последовательности экспрессионных событий (следует отметить, что cII нестабилен в клетках, подвергающихся SOS-ответу). Однако есть одно заметное отличие. Функция LexA в SOS-ответе. Экспрессия LexA приводит к ингибированию различных генов, включая сам LexA.

Контроль выделения фагового генома при индукции

Геном фага по-прежнему встроен в геном хозяина и требует вырезания для начала репликации ДНК. Однако, участок sib, расположенный за пределами обычной транскрипции промотора PL, больше не входит в эту рамку считывания (см. схему). Отсутствие sib-домена в мРНК промотора PL приводит к отсутствию шпильки на 3'-конце, и транскрипт перестает быть мишенью для деградации РНКазой III. Новый неповрежденный транскрипт содержит по одной копии генов xis и int, что приводит к образованию примерно одинаковой концентрации белков Xis и Int. Равные концентрации Xis и Int обеспечивают вырезание встроенного генома из генома хозяина для репликации и последующего производства фагов.

Реактивация множественности и реактивация профага

Реактивация множественности (MR) – это процесс, при котором несколько вирусных геномов, каждый из которых несет повреждение, инактивирующее геном, взаимодействуют внутри инфицированной клетки, образуя жизнеспособный вирусный геном. MR был впервые обнаружен на фаге T4, но впоследствии был найден и на фаге λ (а также у многих других бактериальных и млекопитающих вирусов). MR фага λ, инактивированного УФ-излучением, зависит от рекомбинационной функции либо клетки-хозяина, либо заражающего фага. Отсутствие обеих систем рекомбинации приводит к утрате MR. Выживаемость фага λ, подвергшегося УФ-облучению, повышается, когда клетка E. coli является лизогенной по отношению к гомологичному профагу, что называется реактивацией профага. Реактивация профага у фага λ, по-видимому, происходит посредством рекомбинационного механизма восстановления, аналогичного механизму, лежащему в основе MR.

Обзор функции белка

Функция белка в жизненном цикле Регион промотора Описание cIII Регуляторный белок CIII. Лизогения, стабильность cII PL (Clear 3) Белок, связывающийся с HflB (FtsH), защищает cII от деградации протеазами. cII Лизогения, активатор транскрипции PR (Clear 2) Активирует транскрипцию с промоторов PAQ, PRE и PI, транскрибируя cI и int. Низкая стабильность из-за восприимчивости к клеточным HflB (FtsH) протеазам (особенно в здоровых клетках и клетках, подвергающихся SOS-реакции). Высокий уровень cII способствует интеграции и лизогении фага, в то время как низкий уровень cII приводит к лизису. cI Репрессор, поддержание лизогении PRM, PRE (Clear 1) Ингибитор транскрипции, связывает OR1, OR2 и OR3 (аффинность OR1 > OR2 = OR3, т.е. предпочтительно связывает OR1). При низких концентрациях блокирует PR-промотор (предотвращая продукцию cro). При высоких концентрациях снижает собственную продукцию посредством связывания OR3. Репрессор также ингибирует транскрипцию с промотора PL. Подвержен расщеплению RecA* в клетках, подвергающихся SOS-реакции. cro Лизис, контроль оператора репрессора PR Ингибитор транскрипции, связывает OR3, OR2 и OR1 (аффинность OR3 > OR2 = OR1, т.е. предпочтительно связывает OR3). При низких концентрациях блокирует промотор pRM (предотвращая продукцию cI). При высоких концентрациях снижает собственную продукцию посредством связывания OR2 и OR1. Отсутствует кооперативное связывание (см. ниже для связывания cI). O Лизис, репликация ДНК PR Белок репликации O. Инициирует репликацию ДНК фага Lambda путем связывания в сайте ори. P Лизис, репликация ДНК PR Инициирует репликацию ДНК фага Lambda путем связывания с O и субъединицей DnaB. Эти связывания обеспечивают контроль над ДНК-полимеразой хозяина. gam Лизис, репликация ДНК PL Ингибирует деградацию 3'-концов нуклеазой RecBCD хозяина, позволяя продолжать репликацию в виде катящейся репликации. S Лизис PR' Холин, мембранный белок, перфорирующий мембрану во время лизиса. R Лизис PR' Эндолизин, лизоцим, фермент, выходящий из клетки через отверстия, образованные холином, и расщепляющий клеточную стенку. Rz и Rz1 Лизис PR' Формирует мембранный белковый комплекс, разрушающий внешнюю клеточную мембрану после деградации клеточной стенки эндолизином. Spanin, Rz1 (субъединица внешней мембраны) и Rz (субъединица внутренней мембраны). F Лизис PR' Белки головки капсида фага. D Лизис PR' Белок для декорирования головки. E Лизис PR' Основные белки головки. C Лизис PR' Малый капсидный белок. B Лизис PR' Портальный белок B. A Лизис PR' Большой терминазный белок. J Лизис PR' Белок специфичности к хозяину J. M V U G L T Z Лизис PR' Малый хвостовой белок M. K Лизис PR' Вероятная эндопептидаза. H Лизис PR' Хвостовой измеритель длины H. I Лизис PR' Белок сборки хвоста I. FI Лизис PR' Белок упаковки ДНК FI. FII Лизис PR' Белок прикрепления хвоста. tfa Лизис PR' Белки сборки волокон хвоста. int Интеграция генома, эксцизия PI, PL Интеграза, управляет вставкой генома фага в геном хозяина. В условиях низкой концентрации эффекта нет. Если xis имеет низкую концентрацию, а int высокую, это приводит к вставке генома фага. Если xis и int имеют высокие (и примерно равные) концентрации, это приводит к эксцизии геномов фага из генома хозяина. xis Эксцизия генома PI, PL Эксцизиаза и регулятор белка int, управляет эксцизией и вставкой генома фага в геном хозяина. N Антитерминация для транскрипции поздних ранних генов PL Антитерминатор, белок, связывающий РНК и кофактор РНК-полимеразы, связывает РНК (на участках Nut) и переносится на зарождающийся РНК-полимеразу, который только что транскрибировал участок Nut. Эта модификация РНК-полимеразы препятствует распознаванию им терминационных участков, поэтому нормальные сигналы терминации РНК-полимеразы игнорируются, и синтез РНК продолжается в дистальные фаговые гены (cII, cIII, xis, int, O, P, Q). Q Антитерминация для транскрипции поздних литических генов PR Антитерминатор, белок связывания ДНК и кофактор РНК-полимеразы, связывает ДНК (на участках Qut) и переносится на инициирующий РНК-полимеразу. Эта модификация РНК-полимеразы изменяет его распознавание последовательностей терминации, поэтому нормальные игнорируются; эффективны специальные последовательности терминации Q на расстоянии около 20 000 п.н. Q-расширенные транскрипты включают фаговые структурные белки (A, F, Z, J) и гены лизиса (S, R, Rz и Rz1). Регулируется в пониженном направлении антисмысловой мРНК Pantiq во время лизогении. RecA SOS-реакция Белок хозяина Белок восстановления ДНК хозяина, функционирует как копротеаза во время SOS-реакции, аутолитически расщепляя LexA и cI и способствуя лизису.

Литический против лизогенного

диаграмма жизненного цикла умеренных фагов, демонстрирующая как литический, так и лизогенный циклы. Важное различие здесь заключается в выборе между двумя путями: лизогенией и лизисом при заражении, а также в переходе от профага к лизису или продолжению лизогении. Последний определяется исключительно активацией RecA в SOS-ответе клетки, как подробно описано в разделе об индукции. Первый также подвержен влиянию этого: клетка, находящаяся в SOS-ответе, всегда будет лизироваться, поскольку накопление белка cI не допускается. Однако исходное решение о литическом или лизогенном пути при заражении также зависит от белков cII и cIII. В клетках с достаточным количеством питательных веществ активность протеаз высока, что приводит к разрушению cII. Это способствует литическому циклу. В клетках с ограниченным количеством питательных веществ активность протеаз низкая, что стабилизирует cII и способствует лизогенному циклу. cIII, по-видимому, стабилизирует cII как напрямую, так и выступая в качестве конкурентного ингибитора соответствующих протеаз. Это означает, что клетка, находящаяся в неблагоприятных условиях, то есть испытывающая недостаток питательных веществ и находящаяся в более пассивном состоянии, с большей вероятностью перейдет в лизогенный цикл. Это выгодно для фага, поскольку он может оставаться в латентном состоянии в бактерии до наступления более благоприятных условий, что позволит ему создать больше своих копий, используя дополнительные ресурсы и более высокую вероятность заражения других клеток. Полная биофизическая модель, объясняющая решение о лизисе или лизогении у фага лямбда, еще не разработана. Компьютерное моделирование и симуляции предполагают, что случайные процессы во время заражения определяют выбор лизиса или лизогении в отдельных клетках. Однако недавние эксперименты указывают на то, что физические различия между клетками, существующие до заражения, предопределяют, лизируется ли клетка или становится лизогеном.

Как генетический инструмент

Ламбда-фаг широко использовался в качестве модельного организма и является отличным инструментом, изначально в микробиальной генетике, а затем и в молекулярной генетике. Среди его применений – использование в качестве вектора для клонирования рекомбинантной ДНК, применение его сайт-специфической рекомбиназы (int) для перемешивания клонированных ДНК методом Gateway, а также использование его Red-оперона, включающего белки Redα (также называемый "exo"), β и γ, в методе генной инженерии, известном как рекомбинация. 48 кб фрагмент ДНК ламбда-фага не является необходимым для продуктивной инфекции и может быть заменен чужеродной ДНК, которая затем может реплицироваться фагом. Ламбда-фаг легче проникает в бактерии, чем плазмиды, что делает его полезным вектором, способным либо разрушать, либо интегрироваться в ДНК хозяина. Ламбда-фаг также может быть модифицирован и использован в качестве противораковой вакцины, нацеленной на аспартил (аспарагинил)-β-гидроксилазу человека (ASPH, HAAH), эффективность которой была продемонстрирована в случаях гепатоцеллюлярной карциномы у мышей. Ламбда-фаг также имеет важное значение в изучении специализированной трансдукции.