Солевые мостики: сочетание водородных и ионных взаимодействий.

Введение

Комбинация водородных и ионных связей в химии
устройство, используемое в электрохимии

В химии соляный мост представляет собой комбинацию двух нековалентных взаимодействий: водородных связей и ионных связей (рис. 1). Ионное сопряжение – одна из важнейших нековалентных сил в химии, биологических системах, различных материалах и во многих областях применения, таких как ионно-парная хроматография. Оно является наиболее часто наблюдаемым вкладом в стабильность энтропически неблагоприятной свернутой конформации белков. Хотя нековалентные взаимодействия известны как относительно слабые, небольшие стабилизирующие взаимодействия могут суммироваться, внося значительный вклад в общую стабильность конформера. Соляные мосты встречаются не только в белках, но и в супрамолекулярной химии. Термодинамика каждого из них исследуется посредством экспериментальных процедур для определения вклада свободной энергии соляного моста в общую свободную энергию системы.

Соляные мосты в химической склеивающей системе

В воде образование соляных мостов или ионных пар в основном обусловлено энтропией, обычно сопровождается неблагоприятным вкладом ΔH из-за десольватации взаимодействующих ионов при ассоциации. Водородные связи способствуют стабильности ионных пар, например, с протонированными ионами аммония, а с анионами образуются при депротонировании, как в случае карбоксилатов, фосфатов и т.д.; тогда константы ассоциации зависят от pH. Энтропические движущие силы для ионного спаривания (в отсутствие значительного вклада водородных связей) также наблюдаются в метаноле в качестве растворителя. В неполярных растворителях образуются контактные ионные пары с очень высокими константами ассоциации; в газовой фазе энергии ассоциации, например, галогенидов щелочных металлов, достигают 200 кДж/моль. Уравнение Бьеррума или уравнение Фуосса описывают ассоциацию ионных пар как функцию ионных зарядов zA и zB и диэлектрической проницаемости ε среды; соответствующий график зависимости стабильности ΔG от zAzB показывает для более чем 200 ионных пар ожидаемую линейную корреляцию для широкого спектра ионов. Неорганические и органические ионы при умеренной ионной силе I демонстрируют схожие значения ΔG для образования соляных мостов, около 5–6 кДж/моль для 1:1 комбинации аниона и катиона, практически не зависящие от природы (размера, поляризуемости и т.д.) ионов. Значения ΔG аддитивны и приблизительно линейно зависят от зарядов; взаимодействие, например, дважды заряженного фосфат-аниона с одинарно заряженным аммоний-катионом составляет около 2х5 = 10 кДж/моль. Значения ΔG зависят от ионной силы I раствора, как описано уравнением Дебая–Хюккеля; при нулевой ионной силе наблюдается ΔG = 8 кДж/моль. Стабильность пар ионов щелочных металлов в зависимости от заряда аниона z может быть описана более детальным уравнением.

Солевые мосты в белках

Солевой мост чаще всего образуется за счет анионного карбоксилата (RCOO−) аспартата или глутамата и катионного аммония (RNH3+) лизина или гуанидиния (RNHC(NH2)2+) аргинина (рисунок 2). Поскольку в белках содержится множество ионизируемых боковых цепей аминокислот, pH среды, в которой находится белок, играет решающую роль в его стабильности.

Солевые мосты, содержащиеся в комплексах белка - лиганда

Солевые мосты также могут образовываться между белком и лигандами малых молекул. Было обнаружено, что более 1100 уникальных комплексов белок-лиганд из базы данных белковых структур (Protein Databank) образуют солевые мосты со своими белковыми мишенями, что указывает на частое возникновение солевых мостов во взаимодействии белков с лекарственными средствами. Эти комплексы включают структуры различных классов ферментов, таких как гидролазы, трансферазы, киназы, редуктазы, оксидоредуктазы, лиазы и G-белок-связанные рецепторы (GPCR). Недавние исследования показали, что солевые мосты играют важную роль в стабилизации комплексов белок-лиганд, выступая в роли молекулярных защелок, которые стабилизируют конформацию белка и могут многократно повышать активность ингибитора. Следовательно, включение солевых мостов между лигандами и их белковыми мишенями может быть ценным инструментом в рациональном дизайне лекарств.

Методы количественного определения стабильности соляного моста в белках

Вклад соляного мостика в общую стабильность белка в сложенном состоянии может быть оценен с помощью термодинамических данных, полученных в исследованиях мутагенеза и методах ядерного магнитного резонанса. Используя мутированный псевдодикий тип белка, специально мутированный для предотвращения преципитации при высоком pH, вклад соляного мостика в общую свободную энергию сложенного белкового состояния можно определить, выполняя точечную мутацию, изменяя и, следовательно, разрывая соляный мостик. Например, в лизозиме T4 был идентифицирован соляной мостик между аспартатом (Asp) в остатке 70 и гистидином (His) в остатке 31 (рисунок 3). Направленный мутагенез с аспарагином (Asn) (рисунок 4) был проведен, получив три новых мутанта: Asp70Asn His31 (Мутант 1), Asp70 His31Asn (Мутант 2) и Asp70Asn His31Asn (Двойной мутант). После получения мутантов можно использовать два метода для расчета свободной энергии, связанной с соляным мостиком. Один из методов включает наблюдение за температурой плавления белка дикого типа по сравнению с тремя мутантами. Денатурацию можно контролировать с помощью изменения кругового дихроизма. Снижение температуры плавления указывает на снижение стабильности. Это количественно оценивается методом, описанным Бектелем и Шеллманом, где разница свободной энергии между ними рассчитывается через ΔTΔS. Существуют некоторые проблемы с этим расчетом, и его можно использовать только с очень точными данными. В примере с T4 лизозимом ΔS псевдодикого типа ранее сообщалось при pH 5.5, поэтому разница температур в средней точке 11 °C при этом pH, умноженная на сообщенное ΔS 360 кал/(моль·К) (1.5 кДж/(моль·К)), дает изменение свободной энергии примерно −4 ккал/моль (−17 кДж/моль). Это значение соответствует количеству свободной энергии, вносимой в стабильность белка соляным мостиком. Второй метод использует спектроскопию ядерного магнитного резонанса для расчета свободной энергии соляного мостика. Проводится титрование с одновременной регистрацией химического сдвига, соответствующего протонам углерода, соседнего с карбоксилатной или аммониевой группой. Середина титрационной кривой соответствует pKa, или pH, при котором соотношение протонированных и депротонированных молекул равно 1:1. Продолжая пример с T4 лизозимом, титрационная кривая получается путем наблюдения за сдвигом протона C2 гистидина 31 (рисунок 5). Рисунок 5 показывает сдвиг титрационной кривой между диким типом и мутантом, в котором Asp70 заменен на Asn. Соляный мостик образуется между депротонированным Asp70 и протонированным His31. Это взаимодействие вызывает наблюдаемый сдвиг в pKa His31. В развернутом белке дикого типа, где соляный мостик отсутствует, сообщается, что pKa His31 составляет 6.8 в буферах H2O умеренной ионной силы. Рисунок 5 показывает pKa дикого типа 9.05. Эта разница в pKa подтверждается взаимодействием His31 с Asp70. Для поддержания соляного мостика His31 будет стремиться удерживать свой протон как можно дольше. Когда соляный мостик нарушается, как в мутанте D70N, pKa возвращается к значению 6.9, что намного ближе к значению His31 в развернутом состоянии. Разницу в pKa можно количественно оценить, чтобы отразить вклад соляного мостика в свободную энергию. Используя свободную энергию Гиббса: ΔG = −RT ln(Keq), где R - универсальная газовая постоянная, T - температура в кельвинах, а Keq - константа равновесия реакции в состоянии равновесия. Депротонирование His31 является кислотно-основной реакцией равновесия со специальной Keq, известной как константа диссоциации кислоты, Ka: His31 H+ ⇌ His31 + H+. pKa затем связана с Ka следующим образом: pKa = −log(Ka). Расчет разницы свободной энергии мутанта и дикого типа теперь может быть выполнен с использованием уравнения свободной энергии, определения pKa, наблюдаемых значений pKa и связи между натуральными логарифмами и логарифмами. В примере с T4 лизозимом этот подход дал расчетный вклад около 3 ккал/моль в общую свободную энергию. При высоких ионных силах соляной мостик может быть полностью замаскирован, поскольку в нем участвует электростатическое взаимодействие. Соляной мостик His31 Asp70 в лизозиме T4 был закопан внутри белка. Энтропия играет большую роль в поверхностных соляных мостиках, где остатки, которые обычно имеют возможность двигаться, ограничиваются их электростатическим взаимодействием и водородными связями. Это, как было показано, уменьшает энтропию настолько, что почти стирает вклад взаимодействия. Поверхностные соляные мостики можно изучать аналогично закопанным соляным мостикам, используя двойные циклы мутаций и титрования ЯМР. Хотя существуют случаи, когда закопанные соляные мостики способствуют стабильности, как и в любом другом случае, существуют исключения, и закопанные соляные мостики могут оказывать дестабилизирующее действие. Ионное сочетание является наиболее важной движущей силой для комплексообразования анионов, но селективность, например, в ряду галогенов, достигается в основном за счет вклада водородных связей.

The contribution of a salt bridge to the overall stability to the folded state of a protein can be assessed through thermodynamic data gathered from mutagenesis studies and nuclear magnetic resonance techniques. Using a mutated pseudo wild type protein specifically mutated to prevent precipitation at high pH, the salt bridge’s contribution to the overall free energy of the folded protein state can be determined by performing a point mutation, altering and, consequently, breaking the salt bridge. For example, a salt bridge was identified to exist in the T4 lysozyme between aspartic acid (Asp) at residue 70 and a histidine (His) at residue 31 (Figure 3). Site directed mutagenesis with asparagine (Asn) (Figure 4) was done obtaining three new mutants: Asp70Asn His31 (Mutant 1), Asp70 His31Asn (Mutant 2), and Asp70Asn His31Asn (Double Mutant). Once the mutants have been established, two methods can be employed to calculate the free energy associated with a salt bridge. One method involves the observation of the melting temperature of the wild type protein versus that of the three mutants. The denaturation can be monitored through a change in circular dichroism. A reduction in melting temperature indicates a reduction in stability. This is quantified through a method described by Becktel and Schellman where the free energy difference between the two is calculated through ΔTΔS. There are some issues with this calculation and can only be used with very accurate data. In the T4 lysozyme example, ΔS of the pseudo wild type had previously been reported at pH 5.5 so the midpoint temperature difference of 11 °C at this pH multiplied by the reported ΔS of 360 cal/(mol·K) (1.5 kJ/(mol·K)) yields a free energy change of about −4 kcal/mol (−17 kJ/mol). This value corresponds to the amount of free energy contributed to the stability of the protein by the salt bridge. The second method utilizes nuclear magnetic resonance spectroscopy to calculate the free energy of the salt bridge. A titration is performed, while recording the chemical shift corresponding to the protons of the carbon adjacent to the carboxylate or ammonium group. The midpoint of the titration curve corresponds to the pKa, or the pH where the ratio of protonated: deprotonated molecules is 1:1. Continuing with the T4 lysozyme example, a titration curve is obtained through observation of a shift in the C2 proton of histidine 31 (Figure 5). Figure 5 shows the shift in the titration curve between the wild type and the mutant in which Asp70 is Asn. The salt bridge formed is between the deprotonated Asp70 and protonated His31. This interaction causes the shift seen in His31’s pKa. In the unfolded wild type protein, where the salt bridge is absent, His31 is reported to have a pKa of 6.8 in H2O buffers of moderate ionic strength. Figure 5 shows a pKa of the wild type of 9.05. This difference in pKa is supported by the His31’s interaction with Asp70. To maintain the salt bridge, His31 will attempt to keep its proton as long as possible. When the salt bridge is disrupted, like in the mutant D70N, the pKa shifts back to a value of 6.9, much closer to that of His31 in the unfolded state. The difference in pKa can be quantified to reflect the salt bridge’s contribution to free energy. Using Gibbs free energy:
ΔG = −RT ln(Keq), where R is the universal gas constant, T is the temperature in kelvins, and Keq is the equilibrium constant of a reaction in equilibrium. The deprotonation of His31 is an acid equilibrium reaction with a special Keq known as the acid dissociation constant, Ka: His31 H+ His31 + H+. The pKa is then related to Ka by the following: pKa = −log(Ka). Calculation of the free energy difference of the mutant and wild type can now be done using the free energy equation, the definition of pKa, the observed pKa values, and the relationship between natural logarithms and logarithms. In the T4 lysozyme example, this approach yielded a calculated contribution of about 3 kcal/mol to the overall free energy. At high ionic strengths, the salt bridge can be completely masked since an electrostatic interaction is involved. The His31 Asp70 salt bridge in T4 lysozyme was buried within the protein. Entropy plays a larger role in surface salt bridges where residues that normally have the ability to move are constricted by their electrostatic interaction and hydrogen bonding. This has been shown to decrease entropy enough to nearly erase the contribution of the interaction. Surface salt bridges can be studied similarly to that of buried salt bridges, employing double mutant cycles and NMR titrations. Although cases exist where buried salt bridges contribute to stability, like anything else, exceptions do exist and buried salt bridges can display a destabilizing effect. Ion pairing is the most important driving force for anion complexation, but selectivity e. g. within the halide series has been achieved, mostly by hydrogen bonds contributions.

Молекулярные капсулы

Молекулярные капсулы – это химические каркасы, предназначенные для захвата и удержания молекулы-гостя (см. молекулярная инкапсуляция). Сюмна и его коллеги разработали новую молекулярную капсулу с хиральным внутренним пространством. Эта капсула состоит из двух половин, как пластиковое пасхальное яйцо (рисунок 6). Взаимодействия посредством водородных связей между двумя половинами приводят к их самосборке в растворе (рисунок 7). Они стабильны даже при нагревании до 60 °C.

Полимеры с двойной спиралью

Ясима и его коллеги использовали соляные мосты для создания нескольких полимеров, которые принимают конформацию двойной спирали, подобно ДНК. В одном из примеров они использовали платину для создания двойной спиральной металлополимерной структуры. Начиная с их мономера и бифенила платины(II) (рисунок 8), их металлополимер самособирается посредством серии реакций обмена лигандов. Две половины мономера закреплены вместе посредством соляного моста между депротонированным карбоксилатом и протонированными азотами.