Введение

Белок млекопитающих, обнаруженный у Homo sapiens, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT), также известная как ДНК-нуклеотидилэксотрансфераза (DNTT) или терминальная трансфераза, является специализированной ДНК-полимеразой, экспрессируемой в незрелых пре-B, пре-T лимфоидных клетках и клетках острой лимфобластной лейкемии/лимфомы. TdT добавляет N-нуклеотиды к V, D и J экзонам генов TCR и BCR во время рекомбинации генов антител, обеспечивая феномен разнообразия соединений. У человека терминальная трансфераза кодируется геном DNTT. Являясь членом семейства X ДНК-полимераз, она функционирует совместно с полимеразой λ и полимеразой μ, обе из которых принадлежат к одному и тому же семейству X полимераз. Разнообразие, вносимое TdT, сыграло важную роль в эволюции иммунной системы позвоночных, значительно увеличив разнообразие антигенных рецепторов, которыми клетка оснащена для борьбы с патогенами. Исследования на мышах с нокаутом по гену TdT показали резкое снижение (в 10 раз) разнообразия рецепторов Т-клеток (TCR) по сравнению с нормальными, или диким типом. Большее разнообразие TCR, которым обладает организм, приводит к большей устойчивости к инфекциям. Хотя TdT была одной из первых ДНК-полимераз, идентифицированных у млекопитающих в 1960 году, она остается одной из наименее изученных ДНК-полимераз. TdT отсутствует в гематопоэтических стволовых клетках печени плода, что значительно снижает разнообразие соединений в B-клетках в период фетального развития.

Функции и регулирование

Как правило, TdT катализирует добавление нуклеотидов к 3'-концу молекулы ДНК. В отличие от большинства ДНК-полимераз, ему не требуется матрица. Предпочтительным субстратом этого фермента является 3'-свисающий конец, но он также может добавлять нуклеотиды к тупым или углубленным 3'-концам. Более того, TdT – единственная известная полимераза, катализирующая синтез ДНК-полимеров длиной 2–15 нуклеотидов из свободных нуклеотидов в растворе in vivo. In vitro такое поведение катализирует общее образование полимеров ДНК без определенной длины. Предполагается, что ДНК-фрагменты длиной 2–15 нуклеотидов, образующиеся in vivo, участвуют в сигнальных путях, связанных с механизмами репарации и/или рекомбинации ДНК. Однако TdT уникален в своей способности использовать более широкий спектр катионов, таких как Mg<sup>2+</sup>, Mn<sup>2+</sup>, Zn<sup>2+</sup> и Co<sup>2+</sup>. TdT экспрессируется преимущественно в первичных лимфоидных органах, таких как тимус и костный мозг. Регуляция его экспрессии осуществляется посредством множественных путей, включая белок-белковые взаимодействия, например, с TdIF1. TdIF1 – это другой белок, который взаимодействует с TdT, ингибируя его функцию путем маскировки области связывания ДНК TdT-полимеразы. Регуляция экспрессии TdT также происходит на транскрипционном уровне, под влиянием факторов, специфичных для стадии развития, и носит ограничивающий развитие характер. Хотя экспрессия обычно обнаруживается в первичных лимфоидных органах, недавние исследования показали, что стимуляция антигеном может приводить к вторичной экспрессии TdT вместе с другими ферментами, необходимыми для перестройки генов вне тимуса у Т-клеток. Пациенты с острой лимфобластной лейкемией значительно повышают продукцию TdT.

Изменение изоформы

Несколько изоформ TdT были обнаружены у мышей, крупного рогатого скота и человека. На сегодняшний день у мышей выявлено два варианта, а у людей – три. Два варианта сплайсинга, выявленных у мышей, названы в соответствии с их длиной: TdTS состоит из 509 аминокислот, а TdTL, более длинный вариант, – из 529 аминокислот. Различия между TdTS и TdTL находятся вне областей, связывающих ДНК и нуклеотиды. Влияние 20-аминокислотной разницы на ферментативную активность остается спорным: одни утверждают, что модификации TdTL придают ему экзонуклеазную активность, другие – что TdTL и TdTS обладают почти идентичной активностью in vitro. Кроме того, сообщается, что TdTL может модулировать каталитическую активность TdTS in vivo посредством неизвестного механизма. Предполагается, что это способствует регуляции роли TdT в V(D)J-рекомбинации. Изоформы TdT человека представлены тремя вариантами: TdTL1, TdTL2 и TdTS. TdTL1 широко экспрессируется в лимфоидных клеточных линиях, а TdTL2 преимущественно экспрессируется в нормальных малых лимфоцитах. Оба варианта локализуются в ядре при экспрессии и обладают 3'→5'-экзонуклеазной активностью. В отличие от них, изоформы TdTS не обладают экзонуклеазной активностью и осуществляют необходимое удлинение во время V(D)J-рекомбинации. Полимеразы μ и λ демонстрируют аналогичную TdT трансляционно-зависимую синтетическую активность, но без аналогичной зависимости от двухцепочечной ДНК ниже по потоку. Более того, полимераза λ также проявляет аналогичную синтетическую активность, не зависящую от шаблона. Наряду с активностью терминальной трансферазы, она также способна работать в более общем шаблоно-зависимом режиме. Сходство между TdT и полимеразой μ позволяет предположить их тесное эволюционное родство. В иммуногистохимии и проточной цитометрии антитела к TdT могут использоваться для выявления незрелых T- и B-клеток, а также плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих этот антиген, в то время как зрелые лимфоидные клетки всегда TdT-негативны. Хотя TdT-положительные клетки обнаруживаются в небольшом количестве в здоровых лимфатических узлах и миндалинах, злокачественные клетки острой лимфобластной лейкемии также являются TdT-положительными, поэтому антитела могут использоваться в составе панели для диагностики этого заболевания и его дифференциации, например, от мелкоклеточных опухолей у детей. TdT также находит применение в de novo синтезе олигонуклеотидов, причем аналоги TdT dNTP способны к удлинению праймера на 1 нуклеотид за раз. Иными словами, фермент TdT продемонстрировал способность синтезировать ДНК, добавляя по одному нуклеотиду к последовательности праймера.