Ультрамикротомия: техника получения ультратонких срезов.

Введение

Ультратонкое нарезание образцов. Ультрамикротомия – это метод получения чрезвычайно тонких срезов, называемых ультратонкими срезами, которые можно изучать и документировать при различных увеличениях в просвечивающем электронном микроскопе (TEM). В основном используется для биологических образцов, но также возможно получение срезов из пластиков и мягких металлов. Срезы должны быть очень тонкими, поскольку электроны стандартного электронного микроскопа с энергией от 50 до 125 кВ не могут пройти сквозь биологический материал толщиной более 150 нм. Для достижения наилучшего разрешения срезы должны быть толщиной от 30 до 60 нм. Это примерно эквивалентно разрезанию человеческого волоса толщиной 0,1 мм на 2000 ломтиков по диаметру или разрезанию одной красной кровяной клетки на 100 ломтиков.

Ультрамикротомия

Ультратонкие срезы образцов получают с помощью специализированного инструмента, называемого "ультрамикротом". Ультрамикротом оснащается алмазным ножом, который используется для большинства биологических ультратонких срезов, или стеклянным ножом, часто применяемым для первоначальных разрезов. В процессе ультрамикротомии задействовано множество других элементов оборудования. Перед выбором участка блока образца для получения ультратонкого среза техник исследует полутонкие или "толстые" срезы толщиной от 0,5 до 2 мкм. Эти толстые срезы также известны как обзорные и рассматриваются под световым микроскопом для определения, находится ли нужная область образца в положении, подходящем для тонкого разрезания. "Ультратонкие" срезы толщиной от 50 до 100 нм могут быть изучены в просвечивающем электронном микроскопе (TEM). Тканевые срезы, полученные методом ультрамикротомии, сжимаются под действием режущей силы ножа. Кроме того, интерференционная микроскопия поверхности разреза блока показывает, что срезы часто не являются плоскими. При использовании эпона или вестопала в качестве заливочного материала высота неровностей обычно не превышает 0,5 мкм, то есть в 5–10 раз больше толщины обычных срезов (1). Для исследования от образца отбирается небольшой фрагмент. Образцы могут быть получены из биологического материала, такого как ткани животных или растений, или из неорганического материала, например, камня, металла, магнитной ленты, пластика, пленки и т.д. Сначала блок образца подрезают, чтобы получить поверхность размером 1 мм x 1 мм. "Толстые" срезы (1 мкм) готовят для осмотра под оптическим микроскопом. Выбирают область для разрезания для TEM, и поверхность блока подрезают до размеров не более 0,7 мм по каждой стороне. Поверхности блоков обычно имеют квадратную, трапециевидную, прямоугольную или треугольную форму. Наконец, тонкие срезы получают стеклянным или алмазным ножом с помощью ультрамикротома, и срезы оставляют плавать на воде в специальной ванночке или лодочке. Затем срезы извлекают с поверхности воды и закрепляют на медной, никелевой, золотой или другой металлической сетке. Оптимальная толщина среза для просвечивающей электронной микроскопии при ускоряющих напряжениях от 50 кВ до 120 кВ составляет примерно 30–100 нм.

Ultra thin sections of specimens are cut using a specialized instrument called an "ultramicrotome". The ultramicrotome is fitted with either a diamond knife, for most biological ultra thin sectioning, or a glass knife, often used for initial cuts. There are numerous other pieces of equipment involved in the ultramicrotomy process. Before selecting an area of the specimen block to be ultra thin sectioned, the technician examines semithin or "thick" sections range from 0.5 to 2 μm. These thick sections are also known as survey sections and are viewed under a light microscope to determine whether the right area of the specimen is in a position for thin sectioning. "Ultra thin" sections from 50 to 100 nm thick are able to be viewed in the TEM. Tissue sections obtained by ultramicrotomy are compressed by the cutting force of the knife. In addition, interference microscopy of the cut surface of the blocks reveals that the sections are often not flat. With Epon or Vestopal as embedding medium the ridges and valleys usually do not exceed 0.5 μm in height, i. e., 5–10 times the thickness of ordinary sections (1). A small sample is taken from the specimen to be investigated. Specimens may be from biological matter, like animal or plant tissue, or from inorganic material such as rock, metal, magnetic tape, plastic, film, etc. The sample block is first trimmed to create a block face 1 mm by 1 mm in size. "Thick" sections (1 μm) are taken to be looked at on an optical microscope. An area is chosen to be sectioned for TEM and the block face is re trimmed to a size no larger than 0.7 mm on a side. Block faces usually have a square, trapezoidal, rectangular, or triangular shape. Finally, thin sections are cut with a glass or diamond knife using an ultramicrotome and the sections are left floating on water that is held in a boat or trough. The sections are then retrieved from the water surface and mounted on a copper, nickel, gold, or other metal grid. Ideal section thickness for transmission electron microscopy with accelerating voltages between 50kV and 120kV is about 30–100 nm.

Авансы

В 1952 году Умберто Фернандес Моран представил криоультрамикротомию – технику, аналогичную обычной ультрамикротомии, но выполняемую при замораживающих температурах от -20 до -150°C. Криоультрамикротомия позволяет получать ультратонкие срезы замороженных биологических образцов. Одним из преимуществ по сравнению с традиционной ультрамикротомией является скорость: заморозку и получение срезов образца можно осуществить за 1-2 часа.