Ингибиторы удлинения цепи ДНК-полимеразы: дидезоксинуклеотиды и секвенирование ДНК
Dideoxynucleotide
Дидезоксинуклеотиды – ингибиторы ДНК-полимеразы, основа метода Сэнгера для секвенирования ДНК. Прекращают удлинение цепи, обеспечивая точное определение последовательности.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Ингибитор удлинения цепи ДНК-полимеразы
Chain elongating inhibitor of DNA polymerase
Дидезоксинуклеотиды являются ингибиторами удлинения цепи ДНК-полимеразы, используемыми в методе Сангера для секвенирования ДНК. Дидезоксирибонуклеотиды не имеют 3'-гидроксильной группы, поэтому дальнейшее удлинение цепи невозможно после присоединения этого дидезоксинуклеотида. Это приводит к обрыву последовательности ДНК. Таким образом, эти молекулы лежат в основе метода прерывания дидезокси-цепей для секвенирования ДНК, который Фредерик Сэнгер и его команда представили в 1977 году как развитие более ранних работ. Подход Сангера был описан в 2001 году как один из двух фундаментальных методов секвенирования фрагментов ДНК, однако метод Сангера остается "наиболее широко используемым и применяемым в большинстве автоматических секвенаторов ДНК". Сангер получил свою вторую Нобелевскую премию по химии в 1980 году, разделив ее с Уолтером Гилбертом ("за их вклад в определение последовательностей оснований в нуклеиновых кислотах") и Полом Бергом ("за его фундаментальные исследования биохимии нуклеиновых кислот, особенно в области рекомбинантной ДНК"), и обсудил применение дидезоксинуклеотидов в своей нобелевской лекции.
Dideoxynucleotides are chain elongating inhibitors of DNA polymerase, used in the Sanger method for DNA sequencing. The dideoxyribonucleotides do not have a 3' hydroxyl group, hence no further chain elongation can occur once this dideoxynucleotide is on the chain. This can lead to the termination of the DNA sequence. Thus, these molecules form the basis of the dideoxy chain termination method of DNA sequencing, which was reported by Frederick Sanger and his team in 1977 as an extension of earlier work. Sanger's approach was described in 2001 as one of the two fundamental methods for sequencing DNA fragments) but the Sanger method is both the "most widely used and the method used by most automated DNA sequencers." Sanger won his second Nobel Prize in Chemistry in 1980, sharing it with Walter Gilbert ("for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids") and with Paul Berg ("for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant DNA"), and discussed the use of dideoxynucleotides in his Nobel lecture.
Секвенирование ДНК
Дидеоксинуклеотиды полезны при секвенировании ДНК в сочетании с электрофорезом. Образец ДНК, подвергнутый ПЦР (полимеразной цепной реакции) в смеси, содержащей все четыре дезоксинуклеотида и один дидеоксинуклеотид, образует фрагменты ДНК длиной, соответствующей положению каждой азотистой основы, комплементарной тому типу, который содержит дидеоксинуклеотид. Наблюдается закономерность, согласно которой Taq-полимераза, используемая в ПЦР, предпочитает ddGNTP, что подтверждается различными исследованиями. Это означает, что каждая азотистая основа данного типа имеет определенную вероятность присоединения не к дезоксинуклеотиду, а к дидеоксинуклеотиду, что приводит к прекращению удлинения цепи. Следовательно, при последующем электрофорезе для каждой длины, соответствующей комплементарной азотистой основе дидеоксинуклеотида, будет наблюдаться полоса. В настоящее время широко используются флуоресцентные дидеоксинуклеотиды, каждый из четырех имеет уникальный спектр флуоресценции, который может быть зарегистрирован секвенатором, что позволяет проводить секвенирование в одной реакции.
Dideoxynucleotides are useful in the sequencing of DNA in combination with electrophoresis. A DNA sample that undergoes PCR (polymerase chain reaction) in a mixture containing all four deoxynucleotides and one dideoxynucleotide will produce strands of length equal to the position of each base of the type that complements the type having a dideoxynucleotide present. That the taq polymerase used in PCR favors the ddGNTP, is a pattern observed in various research. That is, each nucleotide base of that particular type has a probability of being bonded to not a deoxynucleotide but rather a dideoxynucleotide, which ends chain elongation. Therefore, if the sample then undergoes electrophoresis, there will be a band present for each length at which the complement of the dideoxynucleotide is present. It is now common to use fluorescent dideoxynucleotides such that each one of the four has a different fluorescence that can be detected by a sequencer; thus only one reaction is needed.
Производство
В запатентованном методе тетрагидрофуран использовали в растворителе, содержащем 50 г (0,205 моль) уридина (или, предположительно, любого незащищенного нуклеозида), 112 мл (1,03 моль) метилортоформата и 10 г (52,6 ммоль) паратолуолсульфоновой кислоты при комнатной температуре с перемешиванием. После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов реакционную смесь вылили в водный раствор бикарбоната натрия, после чего 5 раз экстрагировали хлороформом. Экстракт сушили над сульфатом натрия и концентрировали, чтобы получить 49,5 г (0,173 моль) 2',3'-O-метоксиметилиденуридина (выход 84,5%). После этой реакции, продукт – 2',3'-O-метоксиметилиденуридин – растворяют в 50 мл уксусного ангидрида при комнатной температуре с перемешиванием. Раствор нагревали до 140 °C и выдерживали при этой температуре в течение 5 часов с обратным холодильником. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удалили дистилляцией под пониженным давлением, добавили 50 мл воды и экстрагировали смесь 3 раза 100 мл хлороформа. Экстракт концентрировали под пониженным давлением, затем обрабатывали 30% водным аммиаком для получения 82,3% выхода 2',3'-дидеокси-2',3'-дидегидроуридина. Затем этот продукт гидрируют для удаления двойной связи, растворив его в метаноле (10 мл), содержащем катализатор (влажный 5% палладий на углероде) (400 мг) в атмосфере водорода в течение 1 часа, чтобы получить целевой дидеоксинуклеозид (в данном случае 2',3'-дидеоксиуридин). Красящий нуклеотид, который будет использован, вероятно, будет получен путем обработки ферментом фосфорилирования и биотинилирования, а затем реакцией биотинилированного вещества с красителем. Возможно также непосредственное взаимодействие с красителем, но, как утверждается, удлинение линкера повышает эффективность при использовании мутантной формы ДНК-полимеразы.
In a patented method, Tetrahydrofuran was used in a solvent containing 50 g (0.205 mols) of uridine (or, presumably, any unprotected nucleoside), 112 ml (1.03 mols) of methyl orthoformate and 10 g (52.6 mmols) of paratoluenesulfonic acid at room temperature with stirring. After stirring at room temperature for 24 hours, the reaction mixture was poured into an aqueous sodium bicarbonate solution followed by extraction with chloroform 5 times. The extract was dried over sodium sulfate and concentrated to give 49.5 g (0.173 mols) of 2',3' o methoxymethylideneuridine (yield, 84.5%). After this reaction, the uridine example product 2',3' o methoxymethylideneuridine is then dissolved in 50 ml of acetic anhydride at room temperature with stirring. The solution was heated to 140 °C. and kept at this temperature for 5 hours under reflux of the solvent. After cooling to room temperature, the solvent was removed by distillation under reduced pressure, 50 ml of water were added, and the mixture was extracted 3 times with 100 ml of chloroform. The extract was concentrated under reduced pressure, 30% ammonia water to obtain an 82.3% yield of 2',3' dideoxy 2',3' didehydrouridine. This product example is then hydrated to remove the double bond through dissolving it in methanol (10 ml) containing a catalyst (wet 5% palladium on carbon) (400 mg) in an atmosphere of hydrogen for 1 h to obtain the resultant dideoxynucleoside ( 2',3' dideoxyuridine in this case). The dye nucleotide to be used will likely occur by treatment with a phosphorylation enzyme and biotinylation and reaction of the biotinylated substance with the dye. It is possible that immediate reaction with the dye may also occur, but extending the arm is claimed to increase efficiency in the case of using a mutant form of DNA polymerase.