ЯМР-спектроскопия: Эксперимент HSQC для анализа органических молекул и белков
Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy
ЯМР-спектроскопия: эксперимент HSQC для анализа органических молекул и белков. Определение связей 1H с 13C/15N. Применение в многомерных ЯМР-исследованиях.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Гетеронуклеарная одноквантовая когерентность, или эксперимент гетеронуклеарной одноквантовой корреляции, обычно сокращенно HSQC, часто используется в ЯМР-спектроскопии органических молекул и имеет особое значение в области ЯМР белков. Эксперимент был впервые описан Джеффри Боденхаузеном и Д. Дж. Рубеном в 1980 году. Полученный спектр является двумерным (2D), с одной осью для протона (¹H) и другой – для гетероядра (атомного ядра, отличного от протона), которое обычно представляет собой ¹³C или ¹⁵N. Спектр содержит пик для каждого уникального протона, связанного с рассматриваемым гетероядром. Двумерный HSQC также может быть объединен с другими экспериментами в многомерных ЯМР-экспериментах, таких как NOESY HSQC или TOCSY HSQC.
The heteronuclear single quantum coherence or heteronuclear single quantum correlation experiment, normally abbreviated as HSQC, is used frequently in NMR spectroscopy of organic molecules and is of particular significance in the field of protein NMR. The experiment was first described by Geoffrey Bodenhausen and D. J. Ruben in 1980. The resulting spectrum is two dimensional (2D) with one axis for proton (1H) and the other for a heteronucleus (an atomic nucleus other than a proton), which is usually 13C or 15N. The spectrum contains a peak for each unique proton attached to the heteronucleus being considered. The 2D HSQC can also be combined with other experiments in higher dimensional NMR experiments, such as NOESY HSQC or TOCSY HSQC.
Общая схема
Эксперимент HSQC является высокочувствительным двумерным ЯМР-экспериментом и был впервые описан для системы 1H–15N, но применим и к другим ядрам, таким как 1H–13C и 1H–31P. Основная схема этого эксперимента включает перенос магнетизации с протона на второе ядро, которым может быть 15N, 13C или 31P, посредством этапа INEPT (усиление поляризации нечувствительных ядер). После временной задержки (t1) магнетизация возвращается к протону посредством обратного этапа INEPT, после чего регистрируется сигнал. В эксперименте HSQC записывается серия экспериментов с последовательным увеличением временной задержки t1. Сигнал 1H детектируется в непосредственно измеряемом измерении в каждом эксперименте, а химический сдвиг 15N или 13C регистрируется в косвенном измерении, формируемом на основе серии экспериментов.
The HSQC experiment is a highly sensitive 2D NMR experiment and was first described in a 1H—15N system, but is also applicable to other nuclei such as 1H—13C and 1H—31P. The basic scheme of this experiment involves the transfer of magnetization on the proton to the second nucleus, which may be 15N, 13C or 31P, via an INEPT (Insensitive nuclei enhanced by polarization transfer) step. After a time delay (t1), the magnetization is transferred back to the proton via a retro INEPT step and the signal is then recorded. In HSQC, a series of experiments is recorded where the time delay t1 is incremented. The 1H signal is detected in the directly measured dimension in each experiment, while the chemical shift of 15N or 13C is recorded in the indirect dimension which is formed from the series of experiments.
1H15N HSQC
Эксперимент 15N HSQC является одним из наиболее часто регистрируемых экспериментов в ЯМР белков. Эксперимент HSQC может быть выполнен с использованием естественного содержания изотопа 15N, но обычно для ЯМР белков используются изотопно-меченые белки. Такие меченые белки обычно получают путем экспрессии белка в клетках, выращенных на 15N-меченной среде. Каждый остаток белка, за исключением пролина, имеет протон амида, присоединенный к азоту в пептидной связи. HSQC обеспечивает корреляцию между азотом и протоном амида, и каждый амид дает пик в спектрах HSQC. Следовательно, каждый остаток (кроме пролина) может давать наблюдаемый пик в спектрах, хотя на практике не все пики всегда видны из-за ряда факторов. Обычно N-концевой остаток (который имеет присоединенную группу NH3+) нелегко наблюдать из-за обмена с растворителем. Помимо резонансов амидной группы основной цепи, пики также будут давать боковые цепи с протонами, связанными с азотом. В типичном спектре HSQC пики NH2 из боковых цепей аспарагина и глутамина появляются в виде дублетов в правом верхнем углу, а небольшой пик может появляться поверх каждого пика из-за обмена дейтерием из D2O, обычно добавляемой в образец для ЯМР, что придает этим пикам боковых цепей характерный вид. Пики аминогрупп боковых цепей триптофана обычно смещены в область большего поля и появляются в нижнем левом углу. Пики амидной группы основной цепи глицина обычно появляются в верхней части спектра. 15N HSQC обычно является первым гетероядерным спектром, получаемым для назначения резонансов, где каждый пик амида присваивается определенному остатку в белке. Если белок свернут, пики обычно хорошо разделены, и большинство отдельных пиков можно различить. Если в середине спектра наблюдается большое скопление сильно перекрывающихся пиков, это указывает на наличие значительных неструктурированных элементов в белке. В таких случаях, когда наблюдается сильное перекрытие резонансов, назначение резонансов в спектрах может быть затруднено. Для назначения спектра HSQC требуются другие эксперименты, в идеале с использованием тройных резонансных экспериментов с белками, меченными 15N и 13C, которые обеспечивают последовательную связь между остатками, чтобы резонансы можно было связать с конкретными остатками и последовательно назначить. Назначение спектра необходимо для осмысленной интерпретации более сложных ЯМР-экспериментов, таких как определение структуры и анализ релаксации. Химические вещества, меченые изотопом 15N, относительно недороги, а 15N HSQC — чувствительный эксперимент, позволяющий получить спектр за относительно короткое время. Поэтому 15N HSQC часто используется для скрининга кандидатов на предмет их пригодности для определения структуры методом ЯМР, а также для оптимизации условий образца. Трудоемкий процесс определения структуры обычно не предпринимается, пока не будет получен хороший спектр HSQC. Эксперимент HSQC также полезен для обнаружения интерфейса связывания при взаимодействии белок-белок, а также взаимодействий с лигандами, такими как лекарства. Сравнивая HSQC свободного белка с HSQC, связанным с лигандом, можно наблюдать изменения в химических сдвигах некоторых пиков, и эти пики, вероятно, находятся на поверхности связывания, где связывание нарушает их химические сдвиги. 15N HSQC также может использоваться в анализе релаксации при изучении молекулярной динамики белков, определении константы ионизации и других исследованиях.
The 15N HSQC experiment is one of the most frequently recorded experiments in protein NMR. The HSQC experiment can be performed using the natural abundance of the 15N isotope, but normally for protein NMR, isotopically labeled proteins are used. Such labelled proteins are usually produced by expressing the protein in cells grown in 15N labelled media. Each residue of the protein, with the exception of proline, has an amide proton attached to a nitrogen in the peptide bond. The HSQC provides the correlation between the nitrogen and amide proton, and each amide yields a peak in the HSQC spectra. Each residue (except proline) therefore can produce an observable peak in the spectra, although in practice not all the peaks are always seen due to a number of factors. Normally the N terminal residue (which has an NH3+ group attached) is not readily observable due to exchange with solvent. In addition to the backbone amide resonances, sidechains with nitrogen bound protons will also produce peaks. In a typical HSQC spectrum, the NH2 peaks from the sidechains of asparagine and glutamine appear as doublets on the top right corner, and a smaller peak may appear on top of each peak due to deuterium exchange from the D2O normally added to an NMR sample, giving these sidechain peaks a distinctive appearance. The sidechain amine peaks from tryptophan are usually shifted downfield and appear near the bottom left corner. The backbone amide peaks of glycine normally appear near the top of the spectrum. The 15N HSQC is normally the first heteronuclear spectrum acquired for the assignment of resonances where each amide peak is assigned to a particular residue in the protein. If the protein is folded, the peaks are usually well dispersed, and most of the individual peaks can be distinguished. If there is a large cluster of severely overlapped peaks around the middle of the spectrum, that would indicate the presence of significant unstructured elements in the protein. In such cases where there are severe overlap of resonances the assignment of resonances in the spectra can be difficult. The assignment of the HSQC spectrum requires other experiments, ideally using triple resonance experiments with 15N and 13C labelled proteins, that provide sequential connectivities between residues so that the resonances can be linked to particular residues and sequentially assigned. The assignment of the spectrum is essential for a meaningful interpretation of more advanced NMR experiments such as structure determination and relaxation analysis. Chemicals labelled with 15N isotope are relatively inexpensive, and the 15N HSQC is a sensitive experiment whereby a spectrum can be acquired in a relatively short time, the 15N HSQC is therefore often used to screen candidates for their suitability for structure determination by NMR, as well as optimization of the sample conditions. The time consuming process of structure determination is usually not undertaken until a good HSQC spectrum can be obtained. The HSQC experiment is also useful for detecting binding interface in protein protein interaction, as well the interactions with ligands such as drugs. By comparing the HSQC of the free protein with the one bound to the ligand, changes in the chemical shifts of some peaks may be observed, and these peaks are likely to lie on the binding surface where the binding perturbed their chemical shifts. The 15N HSQC may also be used in relaxation analysis in the studies of molecular dynamics of proteins, the determination of ionization constant, and other studies.
1H13C HSQC
Этот эксперимент выявляет корреляции между атомом углерода и присоединенными к нему протонами. Обычно используется вариант 1H–13C HSQC с постоянным временем (CT), поскольку он позволяет избежать расщепления сигнала из-за гомоядерных 13C–13C J-связей, что снижает спектральное разрешение. Термин "постоянное время" относится ко всему периоду эволюции между двумя стадиями INEPT, который поддерживается постоянным в данном эксперименте. Если этот период эволюции установлен равным величине, обратной константе J-связи, то знак намагниченности атомов углерода, имеющих нечетное число присоединенных алифатических атомов углерода, будет противоположен знаку намагниченности атомов углерода с четным числом таких атомов. Например, если Cβ лейцина проявляется в виде положительного пика (к нему присоединены 2 алифатических атома углерода), то Cγ (к нему присоединены 3 алифатических атома углерода) и Cα (к нему присоединен 1 алифатический атом углерода) будут проявляться отрицательными.
This experiment provides correlations between a carbon and its attached protons. The constant time (CT) version of 1H—13C HSQC is normally used as it circumvents the issue of splitting of signal due to homonuclear 13C—13C J couplings which reduces spectral resolution. The "constant time" refers to the entire evolution period between the two INEPT steps which is kept constant in this experiment. If this evolution period is set to be the inverse of the J coupling constant, then the sign of the magnetization of those carbons with an odd number of aliphatic carbon attached will be opposite to those with an even number. For example, if the Cβ of leucine appears as a positive peak (2 aliphatic carbons attached), then the Cγ (3 aliphatic carbons attached) and Cα (1 aliphatic carbons attached) would appear negative.
1H31P HSQC
Использование 1H–31P HSQC в липидомике встречается относительно редко, однако применение 31P в липидомике началось еще в 1990-х годах. Применение этой методики ограничено по сравнению с масс-спектрометрией из-за необходимости значительно большего объема образца, однако сочетание 1H–31P HSQC с масс-спектрометрией считается всесторонним подходом к липидомике, и методы "двойной спектроскопии" становятся все более доступными.
The use of 1H—31P HSQC is relatively uncommon in lipidomics, however use of 31P in lipidomics dates back to the 1990s. The use of this technique is limited with respect to mass spectrometry due to its requirement for much bigger sample size, however the combination of 1H—31P HSQC with mass spectrometry is regarded as a thorough approach to lipidomics and techniques for 'dual spectroscopy' are becoming available.
Общие ссылки
Спектроскопия ЯМР белков: принципы и практика (1995) Джон Кавана, Уэйн Дж. Фэрбротер, Артур Г. Палмер III, Николас Дж. Скелтон, Академическая пресса
Protein NMR Spectroscopy : Principles and Practice (1995) John Cavanagh, Wayne J. Fairbrother, Arthur G. Palmer III, Nicholas J. Skelton, Academic Press