Введение

Бактериальный дисплей (или бактериальное отображение, или дисплей на поверхности бактерий) — это метод белковой инженерии, используемый для in vitro эволюции белков. Библиотеки полипептидов, представленные на поверхности бактерий, могут быть отобраны с помощью проточной цитометрии или процедур итеративного отбора (биопаннинг). Этот метод белковой инженерии позволяет связать функцию белка с геном, который его кодирует. Бактериальный дисплей может быть использован для поиска целевых белков с желаемыми свойствами и для создания аффинных лигандов, специфичных к клеткам. Эта система может применяться в различных областях, включая создание новых вакцин, идентификацию субстратов ферментов и определение аффинности лиганда к его белку-мишени. Бактериальный дисплей часто сочетается с методами магнитно-активированной клеточной сортировки (MACS) или флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Конкурирующими методами in vitro эволюции белков являются дисплей фагов, дисплей рибосом, дисплей дрожжей и дисплей мРНК. Дисплей бактериофагов является наиболее распространенной системой отображения, однако бактериальный дисплей становится все более популярным по мере преодоления технических сложностей. Бактериальный дисплей в сочетании с FACS также имеет преимущество, заключающееся в том, что это методика, позволяющая проводить анализ в реальном времени.

История

Системы клеточного дисплея впервые были использованы в 1985 году, когда пептиды были генетически слиты с белками, отображаемыми на бактериофаге M13. Дисплей на бактериофагах является широко используемой системой клеточного дисплея, однако он имеет ограничения по размеру отображаемых белков. В 1986 году был разработан бактериальный дисплей, позволяющий осуществлять поверхностное отображение более крупных белков. Бактериальные системы дисплея впервые были представлены Фрейдлом и соавторами и Charbit et al. в 1986 году, когда они использовали бактериальные поверхностные белки OmpA и LamB для отображения пептидов. Фрейдл и соавторы слили пептиды с линкерами с геном *ompA*, что привело к экспрессии пептидов в составе белков OmpA. Они показали, что эти белки стали подвергаться расщеплению протеиназой K, а значит, вставленные пептиды, не являющиеся частью OmpA, стали мишенью для протеиназы K. Введение чужеродных пептидов не оказывало влияния на рост бактериальных клеток. Charbit et al. впервые определили области белка LamB, "допустимые" для вставки чужеродных пептидов (то есть не приводящие к полной потере функциональности белка). Затем они исследовали универсальность этих допустимых участков (пределы размера, природа эпитопа), все из которых располагались в поверхностных петлях тримерного наружного мембранного порина, с целью разработки многовалентных живых бактериальных вакцин (12, 15). Это было первым свидетельством использования методов бактериального дисплея поверхности для экспрессии белков на поверхности клеток, не изменяя при этом функцию клетки.

Принцип

Пептиды очень полезны в качестве терапевтических и диагностических веществ. Их применение становится все более распространенным, а системы дисплея предлагают эффективный способ конструирования пептидов и оптимизации их связывающей способности. Клетки экспрессируют поверхностные белки, которые могут участвовать в широком спектре реакций, включая распознавание других клеток, взаимодействие с ними и клеточную сигнализацию. Многие типы бактерий имеют поверхностные белки, такие как интимин энтеропатогенной E. coli, участвующий в связывании с клетками хозяина, или белок OmpA клеток E. coli, важный для поддержания структуры внешней мембраны. Многие поверхностные белки вовлечены в прикрепление бактериальных клеток и их проникновение в клетку хозяина. С помощью бактериального дисплея можно идентифицировать целевые белки на клетке хозяина. Эти поверхностные белки должны быть сначала транслоцированы через бактериальные клеточные мембраны из цитоплазмы на клеточную поверхность. Грам-отрицательные бактерии имеют дополнительное периплазматическое пространство, которого нет у грам-положительных бактерий, поэтому им сложнее осуществлять транслокацию белков. Дисплей гетерологичных белков на поверхности бактериальной клетки обычно требует слияния белка с поверхностным белком, называемым каркасом.

Строительные леса

Эскафолды используются для экспонирования гетерологичного белка на поверхности бактериальной клетки. Существуют различные эскафолды, которые применялись, такие как белки внешней мембраны, белки фимбрий/жгутиков и CPX (циркулярно переставленный OmpX). Эскафолд CPX позволяет осуществлять слияние пептидов с обоих концов эскафолда. ОМП являются распространенными эскафолдами для бактериального дисплея. Белки также могут быть экспонированы на поверхности бактериальной клетки с использованием автотранспортеров. Автотранспортеры являются частью системы секреции типа V. Обычно они имеют три домена: лидерная последовательность на N-конце; центральный пассажирский домен; домен автотранспортера на C-конце. Гетерологичный белок вставляется в пассажирский домен. Другим методом слияния гетерологичного белка является слияние с фимбриями/жгутиками, которые представляют собой нитевидные выросты на поверхности клетки. На бактериях, преимущественно грамотрицательных, присутствует большое количество фимбрий, поэтому экспонирование белков на фимбриях является более выгодным, чем использование некоторых других поверхностных белков, которые представлены в меньшем количестве. Недостатком использования фимбрий является относительно небольшой лимит размера вставки – 10-30 аминокислот. После слияния гетерологичного белка с белком поверхности бактериальной клетки, он подвергается воздействию фермента, клетки (экспрессирующей целевой белок) или антитела (обычно флуоресцентно меченого), в зависимости от задачи эксперимента. Затем образец пропускают через луч света во время проточной цитометрии (FACS) в очень узкой струе жидкости, чтобы через него могла проходить только одна клетка за раз, и регистрируется испускаемая флуоресценция. Информация о размере клетки может быть получена путем анализа рассеяния света, и если произошло связывание гетерологичного белка с целевым белком/клеткой, будет испускаться больше флуоресценции.

Приложения

Поверхностное представление бактерий может быть использовано в широком спектре приложений, включая аффинный скрининг, картирование эпитопов антител, идентификацию пептидных субстратов, выявление пептидов, связывающихся с клетками, и создание вакцин.

Скрининг на основе аффинитета

Скрининг используется для выявления кажущегося сродства гетерологичных белков, представленных на поверхности бактериальной клетки, к белкам-мишеням. Этот метод обычно комбинируют с проточной цитометрией (FACS), и добавление нефлуоресцентного конкурента целевого белка способствует получению более точных значений сродства связывания. Добавление конкурента уменьшает вероятность повторного связывания белков-мишеней, что повышает точность определения сродства связывания.

Циклические пептидные связующие вещества

Циклические пептиды могут быть успешно представлены на поверхности бактериальных клеток. Путем рандомизации ДНК можно провести скрининг миллионов циклических пептидов, представленных на поверхности клеток, против белковой мишени с использованием высокопроизводительной проточной цитометрии (FACS).

Карта эпитопов антитела

Картографирование эпитопов антител используется для определения специфичности антитела. Эпитоп (участок антигена, с которым связывается антитело) экспрессируется на поверхности бактериальной клетки путем экспрессии участка гена, кодирующего антиген. Проточная цитометрия с использованием флуоресцентно меченых антител применяется для определения количества антител, связывающихся с эпитопом.

Определение пептидных субстратов

Это может быть применено для выявления оптимальных субстратов для протеолитических ферментов. Субстрат представляется на поверхности бактериальной клетки между аффинным лигандом и каркасом, а кинетика протеолиза субстрата измеряется с помощью проточной цитометрии (FACS).

Определение клеточно-связывающих пептидов

Бактериальный дисплей может быть использован для поиска пептидов, связывающихся с определенными клетками, например, с клетками рака молочной железы или стволовыми клетками. Отображаемые белки флуоресцентно маркируются GFP, что позволяет визуализировать взаимодействия между пептидами и целевыми клетками с помощью проточной цитометрии. Для измерения уровней флуоресценции в отсутствие отображаемых пептидов необходимы контрольные образцы. Также требуются образцы, не содержащие отображаемых пептидов, но содержащие клетки млекопитающих и бактериальные клетки (включая каркас).

Доставка вакцины

Введение вакцины – очень распространенное применение бактериального дисплея на поверхности. Существует два типа живых бактериальных вакцин, которые можно создать: обычно патогенные бактерии ослабляются, чтобы утратить патогенность. Комменсальные или бактерии пищевого качества, которые не являются патогенными. Использование бактериального дисплея антигенов на поверхности – ценная альтернатива традиционной разработке вакцин по ряду причин, одна из которых заключается в том, что белки, экспрессируемые на поверхности бактериальной клетки, могут благоприятно выступать в роли адъюванта. Традиционные вакцины требуют добавления адъювантов. Еще одним преимуществом создания вакцин с использованием бактериальных дисплейных систем является возможность включения целой бактериальной клетки в состав живой вакцины. В отличие от бактериофаговых дисплейных систем, которые обычно используются в разработке вакцин для выявления неизвестных эпитопов, бактериальные дисплейные системы применяются для экспрессии известных эпитопов, а клетки выступают в качестве системы доставки вакцины.

Сравнение с дисплеем фагов

При аналогичных условиях отбор бактериальных пептидов для создания модели белка стрептавидина оказался менее успешным.