Введение
В микроскопии отрицательное окрашивание – это широко используемый метод, часто применяемый в диагностической микроскопии, для создания контраста между тонким образцом и оптически непрозрачной жидкостью. В этой технике окрашивается фон, оставляя сам образец неокрашенным и, таким образом, видимым. Это отличается от положительного окрашивания, при котором окрашивается непосредственно сам образец.
Микроскопия яркого поля
Для микроскопии в светлом поле отрицательное окрашивание обычно выполняется с использованием черной чернильной жидкости, такой как нигрозин и тушь. Образец, например, влажная бактериальная культура, распределенная по стеклу, смешивается с отрицательным красителем и высушивается. При рассматривании под микроскопом бактериальные клетки и, возможно, их споры выглядят светлыми на темном окружающем фоне. Разработан альтернативный метод, использующий обычную водостойкую маркерную ручку для нанесения отрицательного красителя.
Трансмиссионная электронная микроскопия
В случае просвечивающей электронной микроскопии непрозрачность для электронов связана с атомным номером, то есть с количеством протонов. Некоторые подходящие отрицательные красители включают молибдат аммония, ацетат уранила, формиат уранила, фосфовольфрамовую кислоту, тетроксид осмия, феррицианид осмия и ауроглюкотионат. Они были выбраны, поскольку сильно рассеивают электроны и хорошо адсорбируются на биологических объектах. Структуры, которые можно подвергнуть отрицательному окрашиванию, значительно меньше тех, что изучаются с помощью светового микроскопа. Этот метод используется для визуализации вирусов, бактерий, бактериальных жгутиков, структур биологических мембран, а также белков или белковых агрегатов, которые обладают низкой способностью к рассеиванию электронов. Некоторые красители, такие как тетроксид осмия и феррицианид осмия, обладают высокой химической активностью. Являясь сильными окислителями, они сшивают липиды, в основном реагируя с ненасыщенными углерод-углеродными связями, тем самым фиксируя биологические мембраны в тканевых образцах и одновременно окрашивая их. Выбор отрицательного красителя в электронной микроскопии может быть очень важным. Раннее исследование растительных вирусов с использованием отрицательно окрашенных отпечатков листьев от больного растения показало только сферические вирусы при использовании одного красителя и только палочковидные вирусы при использовании другого. Подтвержденный вывод заключался в том, что растение страдало от смешанной инфекции двумя различными вирусами. Отрицательное окрашивание как на уровне световой, так и электронной микроскопии никогда не следует проводить с инфекционными организмами без соблюдения строгих мер предосторожности. Отрицательное окрашивание обычно является щадящим методом подготовки и, следовательно, не повышает риск заражения исследователя.
Другие применения
Отрицательная электронная микроскопия также успешно использовалась для изучения и идентификации водных липидных агрегатов, таких как ламеллярные липосомы (le), инвертированные сферические мицеллы (M) и инвертированные гексагональные цилиндрические фазы HII (H) (см. рисунок).