Введение
Анализ потокового баланса (FBA) — это математический метод для моделирования метаболизма в реконструкциях метаболических сетей геномного масштаба. По сравнению с традиционными методами моделирования, FBA требует меньше входных данных для построения модели. Симуляции, выполняемые с использованием FBA, вычислительно не затратны и могут рассчитывать стационарные метаболические потоки для больших моделей (более 2000 реакций) за несколько секунд на современных персональных компьютерах. Связанный метод анализа метаболических путей предназначен для поиска и перечисления всех возможных путей между метаболитами. FBA находит применение в биопроцессной инженерии для систематической идентификации модификаций метаболических сетей микробов, используемых в процессах ферментации, которые повышают выход продуктов промышленно важных химических веществ, таких как этанол и янтарная кислота. Он также использовался для идентификации потенциальных мишеней для лекарств при раке и инфекционных заболеваниях, рационального дизайна питательных сред и изучения взаимодействий хозяин-патоген. Результаты FBA можно визуализировать с помощью карт потоков, подобных изображению справа, которое иллюстрирует стационарные потоки, переносимые реакциями гликолиза. Толщина стрелок пропорциональна потоку через реакцию. FBA формализует систему уравнений, описывающих изменения концентраций в метаболической сети, как скалярное произведение матрицы стехиометрических коэффициентов (стехиометрической матрицы S) и вектора v нерешенных потоков. Правая часть скалярного произведения — нулевой вектор, представляющий систему в стационарном состоянии. Затем используется линейное программирование для вычисления решения потоков, соответствующего стационарному состоянию.
История
Некоторые из самых ранних работ в области FBA датируются началом 1980-х годов. Папутсакис показал, что можно составить уравнения баланса потоков, используя карту метаболизма. Однако именно Уотсон впервые предложил использовать линейное программирование и целевую функцию для определения потоков в метаболическом пути. Первое значительное исследование впоследствии было опубликовано Феллом и Смолом, которые применили анализ баланса потоков в сочетании с более сложными целевыми функциями для изучения ограничений в синтезе жиров.
Подготовка и усовершенствование модели
Ключевые этапы подготовки модели включают: создание метаболической сети без разрывов, добавление ограничений к модели и, наконец, добавление целевой функции (часто называемой функцией биомассы), как правило, для моделирования роста организма, который моделируется.
Метаболическая сеть и программные инструменты
[[Файл:Подготовка к FBA.png|right|thumb|Первые шесть реакций гликолиза, подготовленные для FBA путем добавления целевой функции (красный цвет) и импорта и экспорта питательных веществ (АТФ, АДФ, БДГ, АДГ) через границу системы (зеленая пунктирная линия). Simpheny, MetNetMaker, COBRApy, CarveMe, MIOM или COBREXA.jl. Обычно модели создаются в формате BioPAX или SBML для последующего анализа или визуализации в другом программном обеспечении, хотя это и не обязательно.]
Ограничения
Ключевой частью FBA является возможность наложения ограничений на скорости реакций в метаболических сетях, обеспечивающих их удержание в заданном диапазоне значений. Это позволяет модели более точно имитировать реальный метаболизм. С биологической точки зрения ограничения делятся на два подмножества: граничные ограничения, которые лимитируют поглощение/выделение питательных веществ, и внутренние ограничения, которые лимитируют поток реакций внутри организма. С математической точки зрения, применение ограничений можно рассматривать как сужение пространства решений модели FBA. Помимо ограничений, накладываемых на границы метаболической сети, ограничения могут быть применены и к реакциям, находящимся внутри сети. Эти ограничения обычно просты: они могут ограничивать направление реакции из-за энергетических соображений или максимальную скорость реакции из-за конечности скорости всех реакций в природе.
Ограничения для средств массовой информации
Организмы и все другие метаболические системы нуждаются в поступлении питательных веществ. Обычно скорость поглощения питательных веществ определяется их доступностью (питательное вещество, которое отсутствует, не может быть абсорбировано), их концентрацией и константами диффузии (более высокие концентрации быстро диффундирующих метаболитов абсорбируются быстрее) и механизмом абсорбции (например, активный транспорт или облегченная диффузия по сравнению с простой диффузией). Если скорость абсорбции (и/или выведения) определенных питательных веществ может быть измерена экспериментально, эту информацию можно добавить в качестве ограничения на скорость потока на границах метаболической модели. Это гарантирует, что питательные вещества, которые отсутствуют или не абсорбируются организмом, не включаются в его метаболизм (скорость потока ограничивается нулем), а также обеспечивает соответствие симуляции известным скоростям поглощения питательных веществ. Это предоставляет дополнительный способ убедиться, что моделируемый метаболизм обладает экспериментально подтвержденными свойствами, а не только математически обоснованными.
Ограничения потока, измеренные экспериментально
Некоторые скорости потоков могут быть измерены экспериментально, а потоки в метаболической модели могут быть ограничены с определенной погрешностью, чтобы обеспечить точное воспроизведение этих известных скоростей потоков в симуляции. Скорости потоков легче всего измерить для поглощения питательных веществ на границе сети. Измерение внутренних потоков возможно с использованием радиоактивно меченых или видимых в ЯМР метаболитов. Метаболические модели, готовые к применению FBA с ограничениями, могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения, такого как COBRA Toolbox (доступны реализации в MATLAB и Python), SurreyFBA или веб-приложения FAME. Дополнительные программные пакеты описаны в других источниках. Недавно был опубликован всесторонний обзор такого программного обеспечения и его функциональных возможностей. Альтернатива с открытым исходным кодом доступна в R (языке программирования) в виде пакетов или Sybil для выполнения FBA и других методов моделирования, основанных на ограничениях.
Целевая функция
FBA может предоставить большое количество математически допустимых решений для стационарной задачи. Однако решения, представляющие биологический интерес, – это те, которые производят желаемые метаболиты в правильном соотношении. Целевая функция определяет это соотношение метаболитов. Например, при моделировании роста организма целевая функция обычно определяется как биомасса. Математически это столбец в стехиометрической матрице, элементы которого задают "потребность" или выступают в качестве "поглотителя" для биосинтетических предшественников, таких как жирные кислоты, аминокислоты и компоненты клеточной стенки, которые представлены в соответствующих строках матрицы S. Эти элементы соответствуют экспериментально измеренным пропорциям сухого веса клеточных компонентов. Таким образом, этот столбец представляет собой суммарную реакцию, имитирующую рост и размножение. Следовательно, точность экспериментальных измерений играет ключевую роль в правильном определении функции биомассы и обеспечивает биологическую релевантность результатов FBA, гарантируя, что метаболизм производит метаболиты в правильном соотношении. При моделировании меньших сетей целевую функцию можно изменить соответствующим образом. Например, при изучении путей метаболизма углеводов целевая функция, вероятно, будет определена как определенная доля АТФ и НАДН, тем самым моделируя производство высокоэнергетических метаболитов этим путем.
Оптимизация функции "цель/биомасса"
Линейное программирование может быть использовано для поиска единственного оптимального решения. Наиболее распространенной целью биологической оптимизации для метаболической сети целого организма является выбор вектора потоков, максимизирующего поток через функцию биомассы, составленную из метаболитов, входящих в состав организма и помещенных в стехиометрическую матрицу, обозначаемую или просто .
В более общем случае любая реакция может быть определена и добавлена к функции биомассы с условием ее максимизации или минимизации, если требуется единственное "оптимальное" решение. Альтернативно, и в наиболее общем случае, можно ввести вектор , определяющий взвешенный набор реакций, которые модель линейного программирования должна стремиться максимизировать или минимизировать.
Если в стехиометрической матрице присутствует только одна отдельная функция/реакция биомассы, то упростится до всех нулей, за исключением значения 1 (или любого ненулевого значения) в позиции, соответствующей этой функции биомассы. При наличии нескольких отдельных целевых функций упростится до всех нулей, с указанием взвешенных значений в позициях, соответствующих всем целевым функциям.
Уменьшение пространства раствора биологические соображения для системы
Анализ нулевого пространства матриц реализован в программных пакетах, специализирующихся на матричных операциях, таких как Matlab и Octave. Определение нулевого пространства матрицы **S** позволяет узнать все возможные наборы векторов потоков (или их линейных комбинаций), которые обеспечивают баланс потоков в биологической сети. Преимущество этого подхода становится очевидным в биологических системах, описываемых системами дифференциальных уравнений с большим количеством неизвестных. Скорости в вышеуказанных дифференциальных уравнениях и зависят от скоростей реакций, лежащих в основе этих уравнений. Обычно скорости берутся из кинетической теории Михаэлиса-Ментен, которая учитывает кинетические параметры ферментов, катализирующих реакции, и концентрацию самих метаболитов. Выделение ферментов из живых организмов и измерение их кинетических параметров – сложная задача, как и измерение внутренних концентраций и констант диффузии метаболитов внутри организма. Поэтому подход, основанный на дифференциальных уравнениях, для моделирования метаболизма выходит за рамки современных научных возможностей для всех организмов, кроме наиболее изученных. FBA избегает этого ограничения, используя гомеостатическое предположение, которое является достаточно точным описанием биологических систем. Хотя FBA обходит это биологическое препятствие, математическая проблема большого пространства решений остается. FBA преследует две цели: точное представление биологических ограничений системы и получение распределения потоков, наиболее близкого к естественным потокам в целевой системе/организме. Определенные биологические принципы могут помочь преодолеть математические трудности. В то время как стехиометрическая матрица почти всегда изначально является неопределенной (то есть пространство решений для **S** очень велико), размер этого пространства решений можно уменьшить и сделать его более соответствующим биологии задачи, применяя определенные ограничения к решениям.
Расширения
Успех FBA и понимание его ограничений привели к разработке расширений, направленных на смягчение этих ограничений.
Анализ изменчивости потока
[[Изображение:FVA1TomForth. png|right|thumb|Визуальное и численное представление FVA на полной сети. Иногда представляет интерес выяснить немедленный эффект возмущения или нокаута, поскольку регуляторным изменениям требуется время, а организму необходимо перестроить потоки для оптимального использования другого источника углерода или обхода эффекта нокаута. MOMA предсказывает немедленное субоптимальное распределение потоков после возмущения, минимизируя расстояние (евклидово) между распределением потоков дикого типа, полученным с помощью FBA, и распределением потоков мутанта, используя квадратичное программирование. Это приводит к задаче оптимизации вида: где обозначает распределение потоков дикого типа (или невозмущенного состояния), а – распределение потоков при делеции гена, которое необходимо определить. Это упрощается до:
Это решение MOMA, представляющее распределение потоков сразу после возмущения.
Регулируемая минимизация включения и выключения (ROOM)
ROOM стремится улучшить предсказание метаболического состояния организма после инактивации гена. Он основывается на той же предпосылке, что и MOMA: организм будет стремиться восстановить распределение потоков, максимально приближенное к исходному (дикому типу) после инактивации. Однако, ROOM дополнительно предполагает, что это стационарное состояние достигается посредством серии временных метаболических изменений, опосредованных регуляторной сетью, и что организм будет стремиться минимизировать число необходимых регуляторных изменений для достижения состояния, близкого к дикому типу. Вместо минимизации метрики расстояния, ROOM использует метод смешанного целочисленного линейного программирования.
Динамическая FBA
Динамическая FBA стремится добавить возможность изменения моделей во времени, тем самым частично обходя строгое условие стационарного состояния, характерное для классической FBA. Обычно эта техника включает в себя запуск симуляции FBA, изменение модели на основе результатов этой симуляции и повторный запуск симуляции. Повторяя этот процесс, достигается эффект обратной связи с течением времени.
Сравнение с другими методами
FBA предоставляет менее упрощенный анализ, чем анализ критических точек, при этом требуя значительно меньше информации о константах скоростей реакций и гораздо менее полной реконструкции метаболической сети, чем потребовалось бы для полноценного динамического моделирования. Занимая эту нишу, FBA зарекомендовал себя как очень полезный инструмент для анализа метаболических возможностей клеточных систем.
Анализ точки задавления
В отличие от анализа узких мест, который учитывает только точки в сети, где метаболиты производятся, но не потребляются, или наоборот, FBA представляет собой полноценное моделирование метаболической сети, поскольку рассматривает метаболическую сеть как единое целое (стехиометрическую матрицу) на всех этапах анализа. Это означает, что в модели можно воспроизвести сетевые эффекты, такие как влияние химических реакций в отдаленных метаболических путях друг на друга. Недостатком анализа узких мест в плане моделирования сетевых эффектов является то, что он рассматривает каждую реакцию в сети изолированно и, таким образом, может выявлять важные реакции даже в сильно фрагментированных сетях с множеством пробелов.
Динамическая симуляция метаболизма
В отличие от динамического моделирования метаболизма, FBA исходит из предположения, что внутренняя концентрация метаболитов в системе остаётся постоянной во времени и, таким образом, не способна предоставить решения, отличные от стационарных. Вряд ли FBA сможет, например, смоделировать функционирование нервной клетки. Поскольку внутренняя концентрация метаболитов не учитывается в модели, возможно, что решение FBA может содержать метаболиты в концентрации, превышающей биологически допустимую. Это проблема, которой, вероятно, удастся избежать при динамическом моделировании метаболизма. Одним из преимуществ простоты FBA по сравнению с динамическим моделированием является значительно меньшая вычислительная сложность, позволяющая моделировать большое количество возмущений в сети. Второе преимущество заключается в том, что реконструированная модель может быть существенно проще, поскольку не требуется учитывать скорости ферментативных реакций и влияние сложных взаимодействий на ферментальную кинетику.