Внехромосомная ДНК: структура, функции и применение.

Введение

ДНК, расположенная вне хромосом клетки, и встречающаяся, например, в органеллах или плазмидах. Экстрахромосомная ДНК (сокращенно ecDNA) – это любая ДНК, находящаяся за пределами хромосом, как внутри, так и вне ядра клетки. Большая часть ДНК в геноме организма содержится в хромосомах, расположенных в ядре. Существует множество форм экстрахромосомной ДНК, и хотя некоторые из них выполняют важные биологические функции, у прокариот невирусная экстрахромосомная ДНК в основном представлена плазмидами, а у эукариот – органеллами. Митохондриальная ДНК является основным источником этой экстрахромосомной ДНК у эукариот. Тот факт, что эта органелла содержит собственную ДНК, подтверждает гипотезу о бактериальном происхождении митохондрий, возникших в результате поглощения бактериальных клеток предками эукариотических клеток. Экстрахромосомная ДНК часто используется в исследованиях репликации, поскольку ее легко идентифицировать и выделять. В раковых клетках показано, что ecDNA преимущественно локализуется в ядре (обзор в…). Общее количество определенного плазмида в клетке называется числом копий и может варьироваться от нескольких до сотен копий на клетку. Круглые бактериальные плазмиды классифицируются в соответствии со специальными функциями, которые обеспечивают гены, закодированные на плазмиде. Плазмиды фертильности, или F-плазмиды, обеспечивают возможность конъюгации, в то время как плазмиды резистентности, или R-плазмиды, содержат гены, определяющие устойчивость к различным антибиотикам, таким как ампициллин и тетрациклин. Плазмиды вирулентности содержат генетические элементы, необходимые для приобретения бактериями патогенности. Деградативные плазмиды содержат гены, позволяющие бактериям разлагать различные вещества, такие как ароматические соединения и ксенобиотики. Бактериальные плазмиды также могут участвовать в производстве пигментов, фиксации азота и устойчивости к тяжелым металлам. Естественные круглые плазмиды могут быть модифицированы для включения множества генов резистентности и нескольких уникальных сайтов рестрикции, что делает их ценными инструментами в качестве векторов клонирования в биотехнологии. После доставки в клетку-хозяина продукты генов плазмиды стимулируют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ организма. Плазмиды часто покрывают адъювантом перед введением для усиления иммунного ответа организма. Линейные бактериальные плазмиды были обнаружены у нескольких видов спирохет, включая представителей рода Borrelia (к которому относится возбудитель болезни Лайма), у нескольких видов грамположительных почвенных бактерий рода Streptomyces и у грамотрицательного вида Thiobacillus versutus, бактерии, окисляющей серу. Линейные плазмиды прокариот содержат шпильку или ковалентно связанный белок, прикрепленный к теломерным концам молекулы ДНК. Аденин-тимин-богатые шпильки бактерий Borrelia имеют размер от 5 килобаз (кб) до более 200 кб и содержат гены, ответственные за производство группы основных поверхностных белков, или антигенов, на бактериях, позволяющих им избегать иммунного ответа инфицированного хозяина. Линейные плазмиды, содержащие белок, ковалентно присоединенный к 5'-концу цепей ДНК, известны как инвертроны и могут иметь размер от 9 кб до более 600 кб, состоящие из инвертированных терминальных повторов.

DNA located outside the chromosomes of a cell, and found for example in organelles or plasmids
Extrachromosomal DNA (abbreviated ecDNA) is any DNA that is found off the chromosomes, either inside or outside the nucleus of a cell. Most DNA in an individual genome is found in chromosomes contained in the nucleus. Multiple forms of extrachromosomal DNA exist, and, while some of these serve important biological functions,

In prokaryotes, nonviral extrachromosomal DNA is primarily found in plasmids, whereas, in eukaryotes extrachromosomal DNA is primarily found in organelles. Mitochondrial DNA is a main source of this extrachromosomal DNA in eukaryotes. The fact that this organelle contains its own DNA supports the hypothesis that mitochondria originated as bacterial cells engulfed by ancestral eukaryotic cells. Extrachromosomal DNA is often used in research into replication because it is easy to identify and isolate. In cancer cells, ecDNA have been shown to be primarily isolated to the nucleus (reviewed in The total number of a particular plasmid within a cell is referred to as the copy number and can range from as few as two copies per cell to as many as several hundred copies per cell. Circular bacterial plasmids are classified according to the special functions that the genes encoded on the plasmid provide. Fertility plasmids, or f plasmids, allow for conjugation to occur whereas resistance plasmids, or r plasmids, contain genes that convey resistance to a variety of different antibiotics such as ampicillin and tetracycline. Virulence plasmids contain the genetic elements necessary for bacteria to become pathogenic. Degradative plasmids that contain genes that allow bacteria to degrade a variety of substances such as aromatic compounds and xenobiotics. Bacterial plasmids can also function in pigment production, nitrogen fixation and the resistance to heavy metals. Naturally occurring circular plasmids can be modified to contain multiple resistance genes and several unique restriction sites, making them valuable tools as cloning vectors in biotechnology. Once delivered into the host, the products of the plasmid genes will then stimulate both the innate immune response and the adaptive immune response of the host. The plasmids are often coated with some type of adjuvant prior to delivery to enhance the immune response from the host. Linear bacterial plasmids have been identified in several species of spirochete bacteria, including members of the genus Borrelia (to which the pathogen responsible for Lyme disease belongs), several species of the gram positive soil bacteria of the genus Streptomyces, and in the gram negative species Thiobacillus versutus, a bacterium that oxidizes sulfur. Linear plasmids of prokaryotes are found either containing a hairpin loop or a covalently bonded protein attached to the telomeric ends of the DNA molecule. The adenine thymine rich hairpin loops of the Borrelia bacteria range in size from 5 kilobase pairs (kb) to over 200 kb and contain the genes responsible for producing a group of major surface proteins, or antigens, on the bacteria that allow it to evade the immune response of its infected host. The linear plasmids which contain a protein that has been covalently attached to the 5’ end of the DNA strands are known as invertrons and can range in size from 9 kb to over 600 kb consisting of inverted terminal repeats.

Митохондриальные

Митохондрии, присутствующие в эукариотических клетках, содержат множество копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в митохондриальном матриксе. У многоклеточных животных, включая человека, круговая хромосома мтДНК содержит 13 генов, кодирующих белки, входящие в состав цепи переноса электронов, и 24 гена для митохондриальных РНК; эти гены подразделяются на 2 гена рРНК и 22 гена тРНК. Размер плазмиды мтДНК животных составляет приблизительно 16,6 кб, и, хотя она содержит гены для синтеза тРНК и мРНК, для репликации мтДНК или для трансляции митохондриальных белков по-прежнему необходимы белки, кодируемые ядерными генами. В митохондриальной хромосоме существует только одна область, не содержащая кодирующей последовательности – 1 кб область, известная как D-петля, к которой связываются ядерные регуляторные белки. В случае повреждения мтДНК, ДНК может быть восстановлена посредством путей иссечения оснований, либо поврежденная молекула мтДНК разрушается (без повреждения митохондрии, поскольку в каждой митохондрии содержится множество копий мтДНК). Стандартный генетический код, используемый для трансляции ядерных генов, является универсальным, то есть каждая трехнуклеотидная последовательность ДНК кодирует одну и ту же аминокислоту независимо от вида, из которого взята ДНК. Однако этот код в значительной степени универсален, но несколько отличается в митохондриальной ДНК грибов, животных, протистов и растений.

Хлоропласт

Хлоропласты эукариотов, а также другие растительные пластиды, содержат молекулы внехромосомной ДНК. Большинство хлоропластов содержат весь свой генетический материал в одной кольцевой хромосоме, однако у некоторых видов имеются данные о наличии нескольких меньших кольцевых плазмид. Недавняя теория, ставящая под сомнение общепринятую модель кольцевой ДНК хлоропластов (cpDNA), предполагает, что cpDNA чаще может иметь линейную форму. Одна молекула cpDNA может содержать от 100 до 200 генов и различается по размеру в зависимости от вида. Размер cpDNA у высших растений составляет примерно 120–160 кб. Подобно мтДНК, cpDNA не является полностью автономной и нуждается в продуктах ядерных генов для репликации и синтеза белков хлоропластов. Хлоропласты содержат множество копий cpDNA, и их число может варьироваться не только между видами или типами клеток, но и внутри одной клетки в зависимости от её возраста и стадии развития. Например, содержание cpDNA в хлоропластах молодых клеток на ранних стадиях развития, когда хлоропласты представлены нечеткими пропластидами, значительно выше, чем в зрелых и разросшихся клетках, содержащих полностью сформированные пластиды.

Циркулярный

Экстрахромосомная круговая ДНК (экДНК) присутствует во всех эукариотических клетках, обычно происходит из геномной ДНК и состоит из повторяющихся последовательностей ДНК, встречающихся как в кодирующих, так и в некодирующих областях хромосом. Размер экДНК может варьироваться от менее 2000 пар оснований до более 20 000 пар оснований. У растений экДНК содержит повторяющиеся последовательности, сходные с теми, что обнаружены в центромерных областях хромосом и в повторяющейся спутниковой ДНК. У животных показано, что молекулы экДНК содержат повторяющиеся последовательности, характерные для спутниковой ДНК, 5S рибосомной ДНК и теломерной ДНК. Функции экДНК изучены недостаточно, однако предполагается, что образование элементов экДНК из геномных последовательностей ДНК повышает пластичность эукариотического генома и может влиять на стабильность генома, старение клеток и эволюцию хромосом. Особый тип экстрахромосомной ДНК, обозначаемый как ecDNA, часто встречается в раковых клетках человека.

Вирусная

Вирусная ДНК является примером экстрахромосомной ДНК. Понимание вирусных геномов имеет важное значение для понимания эволюции и мутации вирусов. Некоторые вирусы, такие как ВИЧ и онкогенные вирусы, интегрируют свою ДНК в геном клетки-хозяина. Вирусные геномы могут состоять из одноцепочечной ДНК (ssDNA), двухцепочечной ДНК (dsDNA) и могут существовать как в линейной, так и в кольцевой форме. Одним из примеров инфекции, при которой вирус представляет собой экстрахромосомную ДНК, является вирус папилломы человека (ВПЧ). Геном ДНК ВПЧ проходит три различных стадии репликации: установление, поддержание и амплификация. ВПЧ инфицирует эпителиальные клетки аногенитального тракта и полости рта. Обычно ВПЧ распознается и элиминируется иммунной системой. Распознавание вирусной ДНК является важной частью иммунного ответа. Для персистенции этого вируса кольцевой геном должен реплицироваться и передаваться при клеточном делении.

Распознавание клеткой-хозяином

Клетки могут распознавать чужеродную цитоплазматическую ДНК. Понимание путей распознавания имеет значение для профилактики и лечения заболеваний. У клеток есть сенсоры, способные специфически распознавать вирусную ДНК, такие как путь Toll-подобного рецептора (TLR). TLR-путь был впервые обнаружен у насекомых как механизм, позволяющий определенным типам клеток функционировать как сенсоры, способные обнаруживать различные бактериальные или вирусные геномы и PAMPs (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны). PAMPs известны как мощные активаторы врожденного иммунного сигналинга. У человека существует около 10 Toll-подобных рецепторов (TLRs). Различные TLR у человека распознают различные PAMPs: липополисахариды – TLR4, вирусную двухцепочечную РНК – TLR3, вирусную одноцепочечную РНК – TLR7/TLR8, вирусную или бактериальную неметилированную ДНК – TLR9. TLR9 эволюционировал для обнаружения CpG-ДНК, часто встречающейся в бактериях и вирусах, и для инициирования продукции IFN (интерферонов I типа) и других цитокинов. По этой причине ДНК органелл, включая мтДНК, наследуется от матери. Мутации в мтДНК или другой цитоплазматической ДНК также будут наследоваться от матери. Это однородительское наследование является примером неменделевского наследования. Растения также демонстрируют однородительское наследование мтДНК. Большинство растений наследуют мтДНК по материнской линии, за исключением секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens), которая наследует мтДНК по отцовской линии. Существует две теории, объясняющие, почему отцовская мтДНК редко передается потомству. Одна заключается в том, что концентрация отцовской мтДНК значительно ниже, чем материнской, и поэтому она не обнаруживается у потомства. Вторая, более сложная теория, предполагает разрушение отцовской мтДНК для предотвращения ее наследования. Предполагается, что однородительское наследование мтДНК, характеризующейся высокой частотой мутаций, может быть механизмом поддержания гомоплазмы цитоплазматической ДНК. Экстрахромосомная ДНК обнаружена у Apicomplexa – группы простейших. Паразит малярии (род Plasmodium), патоген, связанный с СПИДом (Taxoplasma и Cryptosporidium), являются представителями группы Apicomplexa. Митохондриальная ДНК (мтДНК) была обнаружена у паразита малярии. У малярийных паразитов обнаружены две формы экстрахромосомной ДНК. Одна из них представляет собой линейную ДНК размером 6 кб, а другая – круговую ДНК размером 35 кб. Эти молекулы ДНК изучаются как потенциальные нуклеотидные мишени для антибиотиков.

Cells can recognize foreign cytoplasmic DNA. Understanding the recognition pathways has implications towards prevention and treatment of diseases. Cells have sensors that can specifically recognize viral DNA such as the Toll like receptor (TLR) pathway. The Toll Pathway was recognized, first in insects, as a pathway that allows certain cell types to act as sensors capable of detecting a variety of bacterial or viral genomes and PAMPS (pathogen associated molecular patterns). PAMPs are known to be potent activators of innate immune signaling. There are approximately 10 human Toll Like Receptors (TLRs). Different TLRs in human detect different PAMPS: lipopolysaccharides by TLR4, viral dsRNA by TLR3, viral ssRNA by TLR7/TLR8, viral or bacterial unmethylated DNA by TLR9. TLR9 has evolved to detect CpG DNA commonly found in bacteria and viruses and to initiate the production of IFN (type I interferons ) and other cytokines. For this reason, organelle DNA, including mtDNA, is inherited from the mother. Mutations in mtDNA or other cytoplasmic DNA will also be inherited from the mother. This uniparental inheritance is an example of non Mendelian inheritance. Plants also show uniparental mtDNA inheritance. Most plants inherit mtDNA maternally with one noted exception being the redwood Sequoia sempervirens that inherit mtDNA paternally. There are two theories why the paternal mtDNA is rarely transmitted to the offspring. One is simply the fact that paternal mtDNA is at such a lower concentration than the maternal mtDNA and thus it is not detectable in the offspring. A second, more complex theory, involves the digestion of the paternal mtDNA to prevent its inheritance. It is theorized that the uniparental inheritance of mtDNA, which has a high mutation rate, might be a mechanism to maintain the homoplasmy of cytoplasmic DNA. Extrachromosomal DNA is found in Apicomplexa, which is a group of protozoa. The malaria parasite (genus Plasmodium), the AIDS related pathogen (Taxoplasma and Cryptosporidium) are both members of the Apicomplexa group. Mitochondrial DNA (mtDNA) was found in the malaria parasite. There are two forms of extrachromosomal DNA found in the malaria parasites. One of these is 6 kb linear DNA and the second is 35 kb circular DNA. These DNA molecules have been researched as potential nucleotide target sites for antibiotics.

Роль экДНК в раке

Амплификация генов – один из наиболее распространенных механизмов активации онкогенов. Геновые амплификации при раке часто локализуются на внехромосомных, циркулярных элементах. Наиболее часто амплифицированные онкогены в раковых опухолях обнаруживаются на экДНК и, как показано, обладают высокой динамичностью, реинтегрируясь в негомологичные хромосомы в виде однородных областей окрашивания (HSR).

ЭкДНК ответственна за значительное число наиболее прогрессирующих и агрессивных форм рака, а также за устойчивость к противоопухолевым препаратам. Циркулярная форма экДНК существенно отличается от линейной структуры хромосомной ДНК, что влияет на патогенез рака. Онкогены, кодируемые на экДНК, демонстрируют чрезвычайно высокую транскрипционную активность, входя в 1% наиболее активно транскрибируемых генов во всем транскриптоме. В отличие от бактериальных плазмид или митохондриальной ДНК, экДНК хроматинизирована, содержит высокий уровень активных гистонных модификаций, но мало репрессивных. Архитектура хроматина экДНК лишена высшего уровня компактизации, характерного для хромосомной ДНК, и является одной из наиболее доступных областей ДНК во всем геноме раковых клеток. ЭкДНК могут образовывать скопления внутри ядра, которые можно назвать центрами экДНК (ecDNA hubs). Пространственная организация этих центров экДНК может приводить к межмолекулярным взаимодействиям между энхансерами и генами, способствуя сверхэкспрессии онкогенов.