Аттенуация: Регуляция транскрипции у бактерий и археи.

Введение

В генетике аттенуация – это регуляторный механизм для некоторых бактериальных оперонов, который приводит к преждевременному завершению транскрипции. Классическим примером аттенуации, используемым во многих вводных учебниках по генетике, является рибосома-опосредованная аттенуация оперона trp. Рибосома-опосредованная аттенуация оперона trp основана на том, что у бактерий транскрипция и трансляция происходят одновременно. Аттенуация включает в себя предварительный сигнал остановки (аттенюатор), расположенный в сегменте ДНК, соответствующем лидирующей последовательности мРНК. Во время аттенуации рибосома задерживается в аттенюаторной области лидирующей последовательности мРНК. В зависимости от метаболических условий, аттенюатор либо останавливает транскрипцию в этой точке, либо позволяет продолжить считывание до структурной части генов мРНК и синтезировать соответствующий белок. Аттенуация – это регуляторная особенность, встречающаяся у архей и бактерий, вызывающая преждевременное завершение транскрипции. Аттенюаторы – это 5'-цис-регуляторные области, которые сворачиваются в одну из двух альтернативных структур РНК, определяющих успешность транскрипции. Сворачивание модулируется сенсорным механизмом, который формирует либо терминатор, не зависящий от Rho, приводящий к прерыванию транскрипции и образованию нефункционального РНК-продукта, либо антитерминаторную структуру, приводящую к образованию функционального РНК-транскрипта. В настоящее время существует множество примеров, когда завершается не транскрипция, а трансляция, посредством секвестрирования последовательности Шайна-Дальгарно (сайта связывания рибосомы) в структуру шпильки. Хотя эти примеры не соответствуют предыдущему определению (транскрипционной) аттенуации, они теперь рассматриваются как варианты одного и того же явления.

Атенуация с опосредованной малыми молекулами (рибосвичи)

Последовательности рибосвичей (в лидирующем участке мРНК) связывают такие молекулы, как аминокислоты, нуклеотиды, сахара, витамины, ионы металлов и другие небольшие лиганды, но значительно сложнее, чем предыдущий класс аттенюаторов.

Атенуация, вызванная белком

Взаимодействие белка с РНК может предотвращать или стабилизировать формирование антитерминаторной структуры. Недавние данные предсказывают существование альтернативных вторичных структур, зависящих от температуры (включая терминаторы, не требующие Rho), расположенных выше по течению от генов белков холодного шока в *E. coli*. Первое наблюдение было связано с двумя отдельными научными фактами. Мутации, инактивирующие ген *trpR* (репрессор), все еще демонстрировали некоторую регуляцию оперона *trp* (эти мутанты не были полностью индуцированы или репрессированы триптофаном). Общий диапазон регуляции оперона *trp* составляет около 700-кратный (включение/выключение). При инактивации репрессора *trp* сохранялось регулирование примерно в 10 раз в зависимости от наличия или отсутствия триптофана. При определении последовательности начала оперона *trp* непосредственно перед ORFs известных структурных генов, кодирующих ферменты биосинтеза триптофана, была обнаружена необычная открытая рамка считывания (ORF). Общая структурная информация, представленная ниже, была получена на основе последовательности оперона *trp*. Во-первых, Янофский обнаружил, что ORF содержит два тандемных кодона Trp, а содержание триптофана в белке примерно в 10 раз превышает норму. Во-вторых, мРНК в этой области содержала участки диадной симметрии, позволяющие ей формировать две взаимоисключающие вторичные структуры. Одна из структур соответствовала сигналу ро-независимого завершения транскрипции. Другая вторичная структура, если она формируется, препятствует образованию этой структуры и, следовательно, терминатора. Эта структура называется "преемтором".

Оперон trp

Примером является ген *trp* у бактерий. Когда в области присутствует высокий уровень триптофана, бактерии нецелесообразно синтезировать его больше. Когда РНК-полимераза связывается и транскрибирует ген *trp*, рибосома начинает трансляцию. (Это отличается от эукариотических клеток, где РНК должна выйти из ядра, прежде чем начнется трансляция.) Атенюаторная последовательность, расположенная между лидирующей последовательностью мРНК (5' UTR) и генной последовательностью оперона *trp*, содержит четыре домена, где домен 3 может спариваться с доменом 2 или доменом 4. Атенюаторная последовательность в домене 1 содержит инструкции для синтеза пептида, требующего триптофаны. Высокий уровень триптофана позволяет рибосомам транслировать домены 1 и 2 атенюаторной последовательности, что позволяет доменам 3 и 4 формировать шпилечную структуру, приводящую к прекращению транскрипции оперона *trp*. Поскольку кодирующие белок гены не транскрибируются из-за rho-независимой терминации, синтез триптофана не происходит. Напротив, низкий уровень триптофана означает, что рибосома будет останавливаться в домене 1, вызывая формирование доменов 2 и 3 другой шпилечной структуры, которая не сигнализирует о прекращении транскрипции. Следовательно, остальная часть оперона будет транскрибироваться и транслироваться, чтобы триптофан мог быть произведен. Таким образом, домен 4 является аттенюатором. Без домена 4 трансляция может продолжаться независимо от уровня триптофана. Атенюаторная последовательность имеет свои кодоны, транслируемые в лидирующий пептид, но не является частью генной последовательности оперона *trp*. Атенюатор дает больше времени для формирования петлевых структур в доменах атенюаторной последовательности, но не производит белок, используемый в последующем синтезе триптофана. Аттенюация – это второй механизм отрицательной обратной связи в опероне *trp*. В то время как репрессор TrpR снижает транскрипцию в 70 раз, аттенюация может дополнительно снизить ее в 10 раз, обеспечивая накопленное подавление примерно в 700 раз. Аттенюация возможна благодаря тому, что у прокариот (у которых нет ядра) рибосомы начинают транслировать мРНК, в то время как РНК-полимераза все еще транскрибирует последовательность ДНК. Это позволяет процессу трансляции напрямую влиять на транскрипцию оперона. В начале транскрибируемых генов оперона *trp* находится последовательность из 140 нуклеотидов, называемая лидирующим транскриптом (*trpL*). Этот транскрипт включает четыре короткие последовательности, обозначенные 1–4. Последовательность 1 частично комплементарна последовательности 2, которая частично комплементарна последовательности 3, которая частично комплементарна последовательности 4. Таким образом, могут образовываться три различные вторичные структуры (шпильки): 1–2, 2–3 или 3–4. Гибридизация нитей 1 и 2 для образования структуры 1–2 предотвращает образование структуры 2–3, в то время как образование 2–3 предотвращает образование 3–4. Структура 3–4 является последовательностью прекращения транскрипции; как только она сформируется, РНК-полимераза диссоциирует от ДНК, и транскрипция структурных генов оперона не произойдет. Часть лидирующего транскрипта кодирует короткий полипептид из 14 аминокислот, называемый лидирующим пептидом. Этот пептид содержит два соседних остатка триптофана, что необычно, поскольку триптофан является довольно редкой аминокислотой (около одного из ста остатков в типичном белке *E. coli* – это триптофан). Если рибосома пытается транслировать этот пептид, когда уровень триптофана в клетке низок, она остановится на одном из двух кодонов *trp*. В состоянии остановки рибосома физически экранирует последовательность 1 транскрипта, тем самым препятствуя формированию вторичной структуры 1–2. После этого последовательность 2 может свободно гибридизироваться с последовательностью 3 для образования структуры 2–3, которая предотвращает образование терминальной шпильки 3–4. РНК-полимераза может свободно продолжать транскрибировать весь оперон. Если уровень триптофана в клетке высок, рибосома будет транслировать весь лидирующий пептид без перерыва и остановится только во время завершения трансляции на стоп-кодоне. В этот момент рибосома физически экранирует обе последовательности 1 и 2. Следовательно, последовательности 3 и 4 могут свободно формировать структуру 3–4, которая завершает транскрипцию. В результате оперон будет транскрибироваться только тогда, когда триптофан недоступен для рибосомы, в то время как транскрипт *trpL* экспрессируется конститутивно. Чтобы обеспечить связывание рибосомы и начало трансляции лидирующего транскрипта сразу после его синтеза, в последовательности *trpL* существует сайт паузы. Достигнув этого сайта, РНК-полимераза приостанавливает транскрипцию и, по-видимому, ждет начала трансляции. Этот механизм обеспечивает синхронизацию транскрипции и трансляции, ключевой элемент аттенюации. Аналогичный механизм аттенюации регулирует синтез гистидина, фенилаланина и треонина.

An example is the trp gene in bacteria. When there is a high level of tryptophan in the region, it is inefficient for the bacterium to synthesize more. When the RNA polymerase binds and transcribes the trp gene, the ribosome will start translating. (This differs from eukaryotic cells, where RNA must exit the nucleus before translation starts.) The attenuator sequence, which is located between the mRNA leader sequence (5' UTR) and trp operon gene sequence, contains four domains, where domain 3 can pair with domain 2 or domain 4. The attenuator sequence at domain 1 contains instruction for peptide synthesis that requires tryptophans. A high level of tryptophan will permit ribosomes to translate the attenuator sequence domains 1 and 2, allowing domains 3 and 4 to form a hairpin structure, which results in termination of transcription of the trp operon. Since the protein coding genes are not transcribed due to rho independent termination, no tryptophan is synthesised. In contrast, a low level of tryptophan means that the ribosome will stall at domain 1, causing the domains 2 and 3 to form a different hairpin structure that does not signal termination of transcription. Therefore, the rest of the operon will be transcribed and translated, so that tryptophan can be produced. Thus, domain 4 is an attenuator. Without domain 4, translation can continue regardless of the level of tryptophan. The attenuator sequence has its codons translated into a leader peptide, but is not part of the trp operon gene sequence. The attenuator allows more time for the attenuator sequence domains to form loop structures, but does not produce a protein that is used in later tryptophan synthesis. Attenuation is a second mechanism of negative feedback in the trp operon. While the TrpR repressor decreases transcription by a factor of 70, attenuation can further decrease it by a factor of 10, thus allowing accumulated repression of about 700 fold. Attenuation is made possible by the fact that in prokaryotes (which have no nucleus), the ribosomes begin translating the mRNA while RNA polymerase is still transcribing the DNA sequence. This allows the process of translation to directly affect transcription of the operon. At the beginning of the transcribed genes of the trp operon is a sequence of 140 nucleotides termed the leader transcript (trpL). This transcript includes four short sequences designated 1–4. Sequence 1 is partially complementary to sequence 2, which is partially complementary to sequence 3, which is partially complementary to sequence 4. Thus, three distinct secondary structures (hairpins) can form: 1–2, 2–3 or 3–4. The hybridization of strands 1 and 2 to form the 1–2 structure prevents the formation of the 2–3 structure, while the formation of 2 3 prevents the formation of 3–4. The 3–4 structure is a transcription termination sequence, once it forms RNA polymerase will disassociate from the DNA and transcription of the structural genes of the operon will not occur. Part of the leader transcript codes for a short polypeptide of 14 amino acids, termed the leader peptide. This peptide contains two adjacent tryptophan residues, which is unusual, since tryptophan is a fairly uncommon amino acid (about one in a hundred residues in a typical E. coli protein is tryptophan). If the ribosome attempts to translate this peptide while tryptophan levels in the cell are low, it will stall at either of the two trp codons. While it is stalled, the ribosome physically shields sequence 1 of the transcript, thus preventing it from forming the 1 2 secondary structure. Sequence 2 is then free to hybridize with sequence 3 to form the 2 3 structure, which then prevents the formation of the 3 4 termination hairpin. RNA polymerase is free to continue transcribing the entire operon. If tryptophan levels in the cell are high, the ribosome will translate the entire leader peptide without interruption and will only stall during translation termination at the stop codon. At this point the ribosome physically shields both sequences 1 and 2. Sequences 3 and 4 are thus free to form the 3 4 structure which terminates transcription. The result is that the operon will be transcribed only when tryptophan is unavailable for the ribosome, while the trpL transcript is constitutively expressed. To ensure that the ribosome binds and begins translation of the leader transcript immediately following its synthesis, a pause site exists in the trpL sequence. Upon reaching this site, RNA polymerase pauses transcription and apparently waits for translation to begin. This mechanism allows for synchronization of transcription and translation, a key element in attenuation. A similar attenuation mechanism regulates the synthesis of histidine, phenylalanine and threonine.

Механизм в опероне trp

Предлагаемый механизм, объясняющий, как эта вторичная структура мРНК и лидерный пептид trp могут регулировать транскрипцию биосинтетических ферментов trp, включает следующее. РНК-полимераза инициирует транскрипцию промотора trp. РНК-полимераза останавливается примерно на нуклеотиде 90 в области вторичной структуры (первая из показанных выше). Рибосомы связываются с этой формирующейся мРНК и инициируют трансляцию лидерного пептида. Затем РНК-полимераза "освобождается" от остановки и продолжает транскрипцию. Когда РНК-полимераза достигает области потенциального терминатора, продолжение транскрипции или ее прекращение зависит от положения рибосомы, "отстающей" за ней. Если рибосома останавливается на тандемных кодонах Trp, ожидая соответствующую тРНК, область 1 секвестрируется внутри рибосомы и, следовательно, не может образовывать комплементарные пары оснований с областью 2. Это означает, что области 2 и 3 образуют пары оснований до того, как будет транскрибирована область 4. Это приводит к тому, что область 4, будучи синтезированной, остается одноцепочечной, предотвращая образование терминаторной структуры 3/4. Транскрипция тогда продолжается. Если рибосома транслирует лидерный пептид без задержек, она перекрывает часть области 2, препятствуя образованию комплементарных пар оснований с областью 3. Затем, когда транскрибируется область 4, она образует шпильку с областью 3, и транскрипция прекращается, образуя транскрипт длиной около 140 нуклеотидов. Этот механизм контроля измеряет количество доступной заряженной Trp-тРНК. Положение рибосом определяет, какие альтернативные вторичные структуры формируются.

Атенуация у эукариот

Хотя механизм аттенуации, включающий трансляцию во время продолжающейся транскрипции, подобный механизму для оперона trp (и некоторых других биосинтетических оперонов аминокислот), не работал бы у эукариот, существуют данные, свидетельствующие об аттенуации у эукариот. Исследования, посвященные процессингу микроРНК, предоставляют доказательства эукариотической аттенуации: после котранскрипционного эндонуклеотического расщепления Drosha, 5'-3' экзонуклеаза XRN2 может остановить дальнейшую транскрипцию посредством торпедного механизма.