Введение

Семейство транспортных белковых комплексов

Вакуолярная АТФаза (V-АТФаза) – это высококонсервативный, эволюционно древний фермент с удивительно разнообразными функциями в эукариотических организмах. V-АТФазы подкисляют широкий спектр внутриклеточных органелл и перекачивают протоны через плазматические мембраны многочисленных типов клеток. V-АТФазы связывают энергию гидролиза АТФ с транспортом протонов через внутриклеточные и плазматические мембраны эукариотических клеток. Обычно V-АТФазу рассматривают как полярную противоположность АТФ-синтазы, поскольку АТФ-синтаза представляет собой протоновый канал, использующий энергию протонного градиента для синтеза АТФ. Однако V-АТФаза является протонным насосом, использующим энергию гидролиза АТФ для создания протонного градиента. АТФаза архейского типа (A-АТФаза) – родственная группа АТФаз, обнаруженных у архей, которые часто функционируют как АТФ-синтазы. Она образует кладу V/A-АТФаз с V-АТФазой. Большинство представителей обеих групп транспортируют протоны, но некоторые эволюционировали, чтобы использовать вместо них ионы натрия.

Роли, которые играют V-АТФазы

В-АТФазы обнаружены в мембранах многих органелл, таких как эндосомы, лизосомы и секреторные везикулы, где они выполняют разнообразные функции, критически важные для работы этих органелл. Например, протонный градиент, создаваемый В-АТФазами через вакуолярную мембрану дрожжей, обеспечивает захват кальция в вакуоль посредством антипортерной системы. В синаптической передаче в нейронных клетках В-АТФаза подкисляет синаптические везикулы. Норадреналин поступает в везикулы с помощью В-АТФазы. В-АТФазы также находятся в плазменных мембранах широкого спектра клеток, таких как интеркалированные клетки почек, остеокласты (клетки, разрушающие кость), макрофаги, нейтрофилы, сперматозоиды, клетки средней кишки насекомых и некоторые опухолевые клетки. Плазменные мембранные В-АТФазы участвуют в процессах, таких как pH-гомеостаз, сопряженный транспорт и метастазирование опухолей. В-АТФазы в акросомальной мембране сперматозоидов подкисляют акросому. Это подкисление активирует протеазы, необходимые для проникновения через плазменную мембрану яйцеклетки. В-АТФазы в плазменной мембране остеокластов перекачивают протоны на поверхность кости, что необходимо для резорбции кости. В интеркалированных клетках почек В-АТФазы перекачивают протоны в мочу, обеспечивая реабсорбцию бикарбоната в кровь. Кроме того, важными функциями В-АТФаз являются участие в различных биологических процессах, таких как доставка токсинов, проникновение вирусов, таргетинг на мембраны, апоптоз, регуляция цитоплазматического pH, протеолитический процесс и подкисление внутриклеточных систем. В-АТФазы также играют значительную роль в развитии клеточного морфогенеза. Нарушение гена *vma1*, кодирующего каталитическую субъединицу (А) фермента, серьезно нарушает скорость роста, дифференцировку и способность к образованию жизнеспособных спор у гриба *Neurospora crassa*.

Структура

Наиболее хорошо изучена V-АТФаза дрожжей. Для формирования функционального комплекса V-АТФазы, состоящего из двух доменов, идентифицировано как минимум тринадцать субъединиц. Субъединицы относятся либо к домену Vo (субъединицы, связанные с мембраной, обозначены строчными буквами на рисунке), либо к домену V1 (периферически связанные субъединицы, обозначены прописными буквами на рисунке). V1 включает восемь субъединиц, A и H, с тремя копиями каталитических субъединиц A и B, тремя копиями статорных субъединиц E и G и одной копией регуляторных субъединиц C и H. Кроме того, домен V1 также содержит субъединицы D и F, которые формируют центральную ось ротора. Домен V1 содержит тканеспецифические изоформы субъединиц, включая B, C, E и G. Мутации в изоформе B1 приводят к дистальному почечному тубулярному ацидозу и сенсоневральной глухоте. Домен Vo содержит шесть различных субъединиц: a, d, c, c', c" и e, при этом стехиометрия c-кольца остается предметом дискуссий, а для V-АТФазы табачного бражника (Manduca sexta) постулируется декамерная структура. Домен Vo млекопитающих содержит тканеспецифические изоформы субъединиц a и d, в то время как V-АТФаза дрожжей содержит две органеллоспецифические изоформы субъединицы a: Vph1p и Stv1p. Мутации в изоформе a3 приводят к развитию у человека детского злокачественного остеопетроза, а мутации в изоформе a4 – к дистальному почечному тубулярному ацидозу, в некоторых случаях сопровождающемуся сенсоневральной глухотой. Домен V1 отвечает за гидролиз АТФ, а домен Vo – за транслокацию протонов. Гидролиз АТФ в каталитических центрах связывания нуклеотидов на субъединице A приводит к вращению центральной оси, состоящей из субъединиц D и F, что, в свою очередь, вызывает вращение цилиндра из субъединиц c относительно субъединицы a. Сложная структура V-АТФазы была установлена на основе структур комплексов M. Sexta и дрожжей, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии отдельных частиц и негативного контрастирования соответственно. Эти структуры показали, что V-АТФаза имеет сеть из трех статоров, связанных плотным кольцом, образованным субъединицами C, H и a, которые, разделяя домены V1 и Vo, не взаимодействуют с центральной осью ротора, образованной субъединицами F, D и d. Вращение этой центральной оси ротора, вызванное гидролизом АТФ в каталитических доменах AB, приводит к перемещению цилиндра из субъединиц c относительно субъединицы a, что обеспечивает транспорт протонов через мембрану. Джонсон предположил стехиометрию в два протона, транслоцированных на каждую гидролизованную молекулу АТФ. Помимо структурных субъединиц V-АТФазы дрожжей, были идентифицированы ассоциированные белки, необходимые для сборки. Эти ассоциированные белки необходимы для сборки домена Vo и называются Vma12p, Vma21p и Vma22p. Два из трех белков, Vma12p и Vma22p, образуют комплекс, который временно связывается с Vph1p (субъединица a), чтобы способствовать его сборке и созреванию. Vma21p координирует сборку субъединиц Vo, а также сопровождает домен Vo в везикулы для транспорта в аппарат Гольджи.

V1

Домен V1 V-АТФазы — место гидролиза АТФ. В отличие от Vo, домен V1 гидрофилен.

Функция подраздела C

Субъединица С играет важную роль в контроле сборки V-АТФазы, выступая в качестве гибкого статора, который удерживает вместе каталитический (V1) и мембранный (VO) секторы фермента. Выделение субъединицы С из комплекса АТФазы приводит к диссоциации V1- и Vo-субкомплексов, что является важным механизмом контроля активности V-АТФазы в клетках. По сути, создавая высокий электрохимический градиент и низкий pH, это обеспечивает работу фермента по созданию большего количества АТФ.

Подразделения Е, Г

Эти связанные субъединицы формируют ножку (ножки) А/V АТФазы. Они важны для сборки и, возможно, функционируют как штанги-толкатели при работе фермента. Субъединица E имеет "колпачок" для соединения с A/B, а субъединица G – нет. Вероятно, они произошли от единого белка в результате дупликации гена.

Подразделение H

Подъединица H участвует только в активности, но не в сборке. Эта подъединица также действует как ингибитор свободных подъединиц V1, останавливая гидролиз АТФ при диссоциации V1 и Vo.

Во

Домен Vo отвечает за перенос протонов. В отличие от АТФ-синтазы F-типа, домен Vo обычно транспортирует протоны против их градиента концентрации. Вращение домена Vo обеспечивает перенос протонов в движении, скоординированном с доменом V1, который отвечает за гидролиз АТФ. Домен Vo гидрофобен и состоит из нескольких диссоциирующих субъединиц.

Подраздел c

Как и АТФ-синтаза F-типа, трансмембранный участок V-АТФазы включает кольцо из мембранных субъединиц, которые преимущественно отвечают за перенос протонов. Однако, в отличие от АТФ-синтазы F-типа, V-АТФаза содержит несколько родственных субъединиц в c-кольце; у грибов, таких как дрожжи, их три (с различной стехиометрией), а у большинства других эукариот – две.

Сборка V-ATPase

V-АТФазы дрожжей не собираются, когда удаляется любой из генов, кодирующих субъединицы, за исключением субъединиц H и c". Без субъединицы H собранная V-АТФаза неактивна, а потеря субъединицы c" приводит к нарушению связи ферментативной активности. Однако, эксперименты с меченым импульсом in vivo показали ранние взаимодействия между субъединицами Vo и V1, в частности, между субъединицами a и B, что указывает на то, что субъединицы добавляются последовательно для формирования единого комплекса в согласованном процессе сборки.

Эволюция V-АТФазы

Сравнительно новый метод, называемый воскрешением генов предков, пролил новый свет на эволюционную историю V-АТФазы. Было показано, как структура V-АТФазы предковой формы, состоящей из двух различных белков, эволюционирует в грибную версию, состоящую из трех различных белков. V-АТФаза типа V похожа на археальную (так называемую) АТФ-синтазу типа A, что подтверждает археальное происхождение эукариотов (например, гипотезу эоцитов, см. также Lokiarchaeota). Редкое обнаружение некоторых линий архей с F-АТФазой и некоторых линий бактерий с А-АТФазой рассматривается как результат горизонтального переноса генов.

Регулирование активности V-АТФазы

Известно, что V-АТФазы специфически ингибируются макролидными антибиотиками, такими как конканамицин (CCA) и балифомицин А1. Регуляция активности V-АТФазы in vivo осуществляется посредством обратимой диссоциации домена V1 от домена Vo. После первоначальной сборки, как у насекомого *Manduca sexta*, так и у дрожжевых V-АТФаз, наблюдается обратимое расщепление на свободные домены Vo и V1 после 2–5 минут лишения глюкозы. Расщепление и повторная сборка V-АТФаз не требуют нового синтеза белка, но нуждаются в неповрежденной микротрубочковой сети.

Остеопетроз

Остеопетроз – это общее название группы наследственных заболеваний, характеризующихся дефектом остеокластической резорбции кости. У человека встречаются как доминантный, так и рецессивный остеопетроз. Автосомно-доминантный остеопетроз проявляется умеренными симптомами у взрослых, испытывающих частые переломы костей из-за их хрупкости. Были идентифицированы три гена, ответственных за рецессивный остеопетроз у людей. Все они непосредственно участвуют в путях генерации и секреции протонов, необходимых для резорбции кости. Один из генов – карбоангидраза II (CAII), мутация в котором вызывает остеопетроз в сочетании с почечным тубулярным ацидозом (тип 3). Мутации гена хлоридного канала ClC7 также приводят к развитию как доминантного, так и рецессивного остеопетроза. У людей выявлено 26 мутаций в субъединице a3 V-АТФазы, содержащейся в остеокластах, которые приводят к аутосомно-рецессивному остеопетрозу.

Дистальный почечный тубулярный ацидоз (dRTA)

Важность активности V-АТФазы в почечной секреции протонов подчеркивается наследственным заболеванием – дистальным почечным тубулярным ацидозом. Во всех случаях почечный тубулярный ацидоз является следствием нарушения нормальных почечных механизмов, регулирующих системный pH. Существует четыре типа почечного тубулярного ацидоза. Тип 1 – это дистальный почечный тубулярный ацидоз, который возникает из-за неспособности коркового собирательного канальца подкислять мочу до pH ниже 5. У некоторых пациентов с аутосомно-рецессивным дРТА также наблюдается сенсоневральная потеря слуха. Наследование этого типа РТА обусловлено либо мутациями в субъединицах V-АТФазы изоформ B1 или a4, либо мутациями гена полосы 3 (также называемого AE1) – обмена Cl/HCO3. Двенадцать различных мутаций в V-АТФазе изоформы B1 и двадцать четыре различных мутации в a4 приводят к развитию дРТА. Заболевание начинается в детстве и проявляется медленно прогрессирующей мышечной слабостью, обычно начинающейся в ногах, и некоторым пациентам в пожилом возрасте может потребоваться использование инвалидной коляски. Белок Vma21 способствует сборке V-АТФазы, а мутации, связанные с XMEA, приводят к снижению активности V-АТФазы и повышению pH в лизосомах.

Номенклатура

Термин Vo имеет строчную букву "o" (не цифру "ноль") в нижнем индексе. Буква "o" обозначает олигомицин, который связывается с гомологичным участком в F-АТФазе. Важно отметить, что в обозначениях человеческих генов в NCBI используется цифра "ноль", а не буква "o". Например, ген человеческой c-субъединицы Vo в базе данных генов NCBI обозначен как "ATP6V0C" (с нулем), а не "ATP6VOC" (с буквой "o"). Многие научные публикации допускают подобную ошибку.