Транспозон Tn10: Механизмы транспозиции и генетическая организация

Введение

Tn10 – это транспозиционный элемент, представляющий собой последовательность ДНК, способную опосредовать собственное перемещение из одной позиции в ДНК организма-хозяина в другую. В природе существует ряд различных механизмов транспозиции, но Tn10 использует нерепликативный механизм вырезания и вставки. Транспозазный белок распознает концы элемента и вырезает его из исходного локуса. Затем белково-ДНК комплекс диффундирует от донорского сайта, пока случайные столкновения не приведут его в контакт с новым целевым сайтом, где он интегрируется. Для осуществления этой реакции транспозаза, белок массой 50 кДа, должна разорвать четыре цепи ДНК, чтобы освободить транспозон от донорского сайта, и выполнить две реакции обмена цепями для интеграции элемента в целевой сайт. Это оставляет две цепи соединенными не полностью в целевом месте, но белки репарации ДНК организма-хозяина справляются с этим. Выбор целевого сайта в основном случаен, но предпочтение отдается последовательности 5' GCTNAGC 3'. Шесть-девять пар оснований, фланкирующих эту последовательность, также влияют на выбор места вставки. Транспозиция вырезания и вставки не приводит к увеличению числа транспозонов как таковых: одна копия присутствует в начале и одна – в конце. Если бы на этом все закончилось, транспозон исчез бы в результате генетического дрейфа и потери копий из-за случайного неуспеха интеграции в целевой сайт. Однако транспозон имеет механизм, способствующий транспозиции сразу после прохождения репликационной вилки, оставляя гемиметилированную копию Tn10 на каждой сестринской хромосоме. Поскольку транспозиция благоприятна, когда Tn10 находится в гемиметилированном состоянии, транспозон с одной сестринской хромосомы может переместиться на другую, в результате чего две копии транспозона окажутся на одной хромосоме. Tn10 имеет композитную структуру и состоит из пары элементов последовательности вставки (IS10), фланкирующих пять генов. Только один из элементов IS10 кодирует функциональную транспозазу. Поскольку концы элемента IS10 содержат сайты распознавания транспозазы, Tn10 имеет в общей сложности четыре таких сайта. Если транспозаза связывается с двумя распознавающими сайтами, фланкирующими элемент IS10, то элемент IS10 подвергается транспозиции независимо от более крупной композитной структуры. Если транспозаза связывается с двумя крайними распознавающими сайтами, то транспозиции подвергается вся композитная структура Tn10. Два из пяти генов, кодируемых центральной частью Tn10, tetA и tetR, обеспечивают устойчивость к антибиотику тетрациклину. Эта активность tetR лежит в основе сборки TetOFF – широко используемой конструкции в исследованиях синтетических генов. Белок TetA является эффлюксным насосом. Он послужил модельной системой для таких белков и стал основой для сотен публикаций, проиндексированных в PubMed. Функции других трех генов, jemA, jemB и jemC, неизвестны, но они могут быть связаны с устойчивостью к тяжелым металлам или окислительному стрессу. Транспозаза Tn10/IS10 тесно связана с другим композитным транспозоном, Tn5/IS50, который содержит ген устойчивости к канамицину в уникальной (т.е. неповторяющейся) центральной области транспозона. Транспозон Tn10 часто используется в генетике для переноса и отбора интересующих генов из одного организма в хромосому другого. Механизм транспозиции Tn10 послужил модельной системой и архетипом для механизмов вырезания и вставки. Однако транспозазу трудно использовать in vitro, и первой была кристаллизована транспозаза Tn5. Tn10 был одним из основных инструментов бактериальной генетики на протяжении многих лет, в течение которых он служил полезным инструментом. Коммерческий набор для транспозиции Tn5 доступен в продаже и широко используется в постгеномных технологиях. Два всесторонних обзора биологии Tn10 доступны в виде глав в книгах Mobile DNA и Mobile DNA II.

Tn10 is a transposable element, which is a sequence of DNA that is capable of mediating its own movement from one position in the DNA of the host organism to another. There are a number of different transposition mechanisms in nature, but Tn10 uses the non replicative cut and paste mechanism. The transposase protein recognizes the ends of the element and cuts it from the original locus. The protein DNA complex then diffuses away from the donor site until random collisions brings it in contact with a new target site, where it is integrated. To accomplish this reaction the 50 kDa transposase protein must break four DNA strands to free the transposon from the donor site, and perform two strand exchange reactions to integrate the element at the target site. This leaves two strands unjoined at the target site, but the host DNA repair proteins take care of this. The target site selection is essentially random, but there is a preference for the sequence 5' GCTNAGC 3'. The 6 9 base pairs that flank the sequence also influence selection of the insertion site. Cut and paste transposition does not cause an increase in the number of transposons per se: there is one copy at the start and one copy at the end. If this was the end of the matter the transposon would perish by genetic drift and the loss of copies owing to the occasional failure to achieve successful integration at the target site. However, the transposon has a mechanism to favor transposition immediately after a replication fork passes through, leaving a hemimethylated copy of Tn10 on each sister chromosome. Since transposition is favored when Tn10 is hemimethylated, the transposon on one sister chromosome can hop somewhere onto the other chromosome so that two copies of the transposon end up on one chromosome. Tn10 has a composite structure and it is composed of a pair of insertion sequence elements (IS10) flanking five genes. Only one of the IS10 elements encodes a functional transposase. Since the ends of the IS10 element contain the transposase recognition sites, Tn10 has a total of four such sites. If the transposase binds the two recognition sites flanking an IS10 element, the IS10 element undergoes transposition independently of the larger composite structure. If the transposase binds the two outermost recognition sites, the whole composite Tn10 structure undergoes transposition. Two of the five genes encoded by the central portion of Tn10, tetA and tetR, confer resistance to the antibiotic tetracycline. This activity of tetR forms the basis of the TetOFF assembly, a widely used construct in synthetic gene studies. The TetA protein is an efflux pump. It has served as a model system for such proteins and has accumulated hundreds of publications indexed in PubMed. The functions of the other three genes, jemA, jemB and jemC, are unknown but they may implicated in heavy metal resistance or oxidative stress. The Tn10/IS10 transposase is closely related to another composite transposon, Tn5/IS50, which harbors a gene for kanamycin resistance in the unique (i. e. non repeated) central region of the transposon. The Tn10 transposon is often used in genetics to transfer and select for genes of interest from one organism into the chromosome of another. The mechanism of Tn10 transposition has served as a model system and the archetype for the cut and paste mechanisms. However, the transposase is difficult to work with in vitro and the Tn5 transposase was the first to be crystallized. Tn10 was one of the great work horses of bacterial genetics for many years during which it served as a useful tool. A commercial kit for Tn5 transposition is commercially available and is extensively used in post genomic technologies. Two comprehensive reviews of Tn10 biology are available as chapters in the book Mobile DNA and Mobile DNA II.