Вирусы рода Potyvirus: структура и функции генома.

Введение

Род положительных нитевых РНК-вирусов семейства Potyviridae.

Потивирус – это род положительных нитевых РНК-вирусов (названный в честь вируса Y картофеля (PVY) – типового вида рода) в семействе Potyviridae. Растения являются естественными хозяевами. Как и бегомовирусы, представители этого рода могут вызывать значительные потери в сельскохозяйственных, пастбищных, садоводческих и декоративных культурах. Более 200 видов тлей распространяют потивирусы, и большинство из них относится к подсемейству Aphidinae (роды Macrosiphum и Myzus). Род включает 190 видов, и на долю потивирусов приходится около тридцати процентов всех известных в настоящее время растительных вирусов.

Структура

Вирион не имеет оболочки и содержит гибкий нитевидный нуклеокапсид длиной от 680 до 900 нанометров (нм) и диаметром 11–20 нм. У видов с монопартитным геномом белок VPg, связанный с геномом, ковалентно присоединен к 5'-концу, а 3'-конец полиаденилирован. Геном кодирует единый открытый кадр считывания (ORF), экспрессируемый в виде полипротеинового прекурсора массой 350 кДа. Этот полипротеин подвергается процессингу с образованием десяти меньших белков: протеазы белка 1 (P1 Pro), протеазы вспомогательного компонента (HC Pro), белка 3 (P3), цилиндрических включений (CI), вирусного геном-связанного белка (Vpg), ядерного включения A (NIa), ядерного включения B (NIb), капсидного белка (CP) и двух небольших предполагаемых белков, известных как 6K1 и 6K2. Цистрон P3 также содержит перекрывающуюся рамку считывания под названием "Довольно интересные Potyviridae ORF" (PIPO). PIPO кодирует альтернативный C-терминал белка P3, который образуется в подмножестве транскриптов в результате сдвига рамки чтения на +2, вызванного механизмом проскальзывания рибосомы в консервативной последовательности повторов GA6. Получающийся белок называется P3N PIPO. Считается, что аналогичный механизм приводит к образованию альтернативной рамки считывания в цистроне P1, названной "довольно интересным ORF сладкого картофельного потивируса" (PISPO), у ряда потивирусов, инфицирующих сладкий картофель, включая вирус пятнистости листьев сладкого картофеля.

Протеома

P1 (~33 килодальтон (kDa) по молекулярной массе) является серин-протеазой, которая облегчает собственное отщепление от полипротеина в месте соединения P1 HC Pro. P1 состоит из консервативного C-концевого протеазного домена и N-концевого региона, который демонстрирует высокий уровень вариаций в последовательности и длине между видами потивируса, но содержит консервативные мотивы внутренней гибкости. P1 также способствует репликации вирусной РНК, хотя и не является для нее необходимой. HC Pro (~52 кДа) – цистеиновая протеаза, расщепляющая дипептид глицин-глицин на своем C-конце. Активность HC Pro регулируется соседним белком P1: прежде чем P1 отщепится от промежуточного комплекса P1 HC Pro, C-конец P1 снижает активность HC Pro по подавлению РНК-интерференции. Хотя точный механизм неизвестен, предполагается, что HC Pro присоединяется к ротовым частям тлей-переносчиков через свой N-концевой цинковый палец-подобный домен и закрепляет вирионы посредством взаимодействия с белком капсида. P3 (~41 кДа) – мембранный белок, необходимый для репликации вируса и накапливающийся в везикулах репликации. Он опосредует взаимодействие между везикулами репликации и белками комплекса передвижения, что может способствовать рекрутированию везикул репликации к комплексу передвижения для эффективного межклеточного перемещения. P3 также взаимодействует с крупной субъединицей рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы. CI (~71 кДа) – РНК-геликаза с АТФазной активностью. Ее наиболее необычным свойством является способность формировать крупные и высокосимметричные конические и цилиндрические включения с центральным полым цилиндром, от которого радиально расходятся ламеллярные структуры, свернутые в узоры, часто описываемые как «ветряные мельницы». Эти включения легко видны на электронных микрофотографиях инфицированных тканей и исторически использовались в качестве диагностического критерия для инфекций потивируса. Включения CI являются основным компонентом комплекса передвижения потивируса, который собирается в плазмодесмах. CI также необходим для репликации вируса и присутствует на репликационных мембранах. Его точный вклад в репликацию неясен, но, как РНК-геликаза, CI, вероятно, облегчает репликацию, разрушая вторичные структуры вирусной РНК. NIa (~50 кДа) образует кристаллические включения в ядре клетки-хозяина. Она расщепляется на NIa Pro и VPg. NIa Pro (~27 кДа) – цистеиновая протеаза, которая обрабатывает большинство участков расщепления полипротеина, за исключением участков саморасщепления P1 и HC Pro. Высокая степень специфичности и консервативности последовательностей расщепления сделала NIa Pro (часто вируса табачной этировки) ценным инструментом в биотехнологии, особенно в приложениях, требующих удаления аффинных меток от рекомбинантных белков после аффинной очистки. Также было показано, что NIa Pro проявляет DNase-активность, не зависящую от последовательности, и вмешивается в метилирование ДНК клетки-хозяина, что позволяет предположить, что NIa и/или NIa Pro изменяют экспрессию генов клетки-хозяина. Потивирусный NIa Pro имеет высокую степень гомологии с 3C-протеазой пикорнавирусов. VPg (~22 кДа) ковалентно присоединена к 5'-концу вирусной геномной РНК посредством уридилирования и, предположительно, действует как праймер для репликации вирусного генома, аналогично белкам VPg пикорнавирусов. Это высокогибкий белок, и его гибкость, как предполагается, позволяет ему взаимодействовать со многими другими вирусными белками. VPg также взаимодействует с различными белками клетки-хозяина, включая фактор инициации эукариотической трансляции 4E (eIF4E), фактор элонгации эукариотической трансляции 1A (eEF1A) и поли(A)-связывающий белок (PABP). NIb (~59 кДа) – РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) II суперсемейства, полимеризующая вирусную РНК во время репликации. Как и NIa, NIb образует включения в ядре клетки-хозяина, куда она транспортируется благодаря двум последовательностям локализации в ядре. NIb имеет типичную для RdRp структуру из трех доменов: «ладонь, большой палец и указательный палец». 6K1 (~6 кДа) – функция неизвестна, но поскольку она накапливается в везикулах репликации и имеет трансмембранный домен, предполагается, что 6K1 способствует вирус-индуцированному образованию везикул. 6K2 (~6 кДа) – трансмембранный белок, перестраивающий мембраны клетки-хозяина в вирус-индуцированные мембранные структуры. Он взаимодействует с различными белками сайта выхода из ЭР, образуя везикулярные и трубчатые расширения, которые в конечном итоге созревают в везикулы репликации. 6K2 имеет три основных домена: N-концевой домен, необходимый для межклеточного перемещения, центральную гидрофобную трансмембранную альфа-спираль и C-концевой домен, необходимый для репликации вируса. P3N PIPO (~25 кДа) – специализированный белок передвижения, закрепляющий комплекс передвижения в плазмодесме. Он также может модулировать предел исключения размера плазмодесмы, взаимодействуя с белками клетки-хозяина, которые разрывают актиновые филаменты плазмодесмы и снижают отложение каллозы. Он взаимодействует как с крупной, так и с малой субъединицами рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы. CP (~30–35 кДа) – белок капсида. Он имеет два концевых домена, которые не упорядочены и экспонированы на поверхности вириона. Центральный основной домен содержит карман для связывания РНК, который связывается с вирусной РНК. Структура белка капсида высоко консервативна у потивирусов, хотя наблюдается относительно высокая степень вариабельности последовательности. Помимо инкапсуляции вириона, основной домен CP необходим для межклеточного перемещения и способствует передаче через семена. Некоторые атипичные потивирусы кодируют дополнительные белки или домены белков, такие как P1 PISPO, алкилирование B (AlkB) и инозинтрифосфатпирофосфатаза (известная как ITPase или HAM1). Такие аномалии часто расположены в гипервариабельном регионе P1 HC Pro. Они не циркулируют и не размножаются внутри тли и обычно сохраняются в тле всего несколько минут. Показано, что некоторые потивирусы изменяют модели питания своих тлей-переносчиков, что может проявляться в увеличении времени, проводимого на зараженных растениях, сокращении времени незондирующего питания и увеличении поглощения флоэмного сока. Передача через семена и пыльцу была задокументирована у некоторых видов потивируса, например, у PVY и вируса мозаики репы (TUMV). Вегетативная передача зараженными клубнями или материалом для прививки вызывает особую озабоченность в отношении определенных сельскохозяйственных культур, таких как картофель и плодовые деревья. Передача также может происходить при физическом контакте с зараженными растениями или с загрязненными инструментами, одеждой или даже водой.

P1 (~33 kilodaltons (kDa) in molecular weight) is a serine protease which facilitates its own cleavage from the polyprotein at the P1 HC Pro junction. P1 consists of a conserved C terminal protease domain and an N terminal region which has a high level of variation in sequence and length between potyvirus species but exhibits conserved patterns of intrinsic disorder. P1 is also promotes viral RNA replication, though it is not required for it. HC Pro (~52 KDa) is a cysteine protease which cleaves a glycine glycine dipeptide at its own C terminus. HC Pro's activity is regulated by the adjacent P1 protein: before P1 cleaves itself off the P1 HC Pro intermediate, the P1 terminus reduces HC Pro's RNA silencing suppression activity. Though the exact mechanism is unknown, HC Pro has been proposed to attach to host aphid mouth parts through its N terminal zinc finger like domain and anchor virions through its interactions with the capsid protein. P3 (~41 kDa) is a membrane protein which is required for viral replication and accumulates in viral replication vesicles. It mediates the interactions between replication vesicles and movement complex proteins which may allow replication vesicles to be recruited to the movement complex for efficient intercellular movement. P3 also interacts with large subunit of the ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase. CI (~71 kDa) is an RNA helicase with ATPase activity. Its most unusual property is its ability to form large and highly symmetrical conical and cylindrical inclusions with a central hollow cylinder from which laminate sheets radiate outward and fold in on themselves in a pattern often described as "pinwheels". These inclusions are easily seen in transmission electron micrographs of infected tissues and were historically used as a diagnostic criterion for potyvirus infections. CI inclusions are a major component of the potyviral movement complex which is assembled at plasmodesmata. CI is also required for viral replication and is present on replication membranes. Its exact contributions to replication are not clear but, as an RNA helicase, CI is likely facilitating replication by dismantling the secondary structures of viral RNA. NIa (~50 kDa) forms crystalline inclusions in the host nucleus. It is cleaved into NIa Pro and VPg. NIa Pro (~27 kDa) is a cysteine protease which processes most of the cleavage sites of the polyprotein. The only exceptions are the self cleavages of P1 and HC Pro. The high degree of cleavage sequence specificity and conservation has made NIa Pro (often that of Tobacco etch virus) a valuable tool in biotechnology, especially in applications which require removing affinity tags from recombinant proteins after affinity purification. NIa Pro has also shown to exhibit sequence independent DNase activity and to interfere with host DNA methylation suggesting that NIa and/or NIa Pro are altering in host gene expression. Potyviral NIa Pro shares a high level of homology with the picornaviral 3C protease. VPg (~22 kDa) is covalently attched to the 5' end of the viral genomic RNA through uridylation and is thought to act as a primer for viral genome replication similarly to the VPg proteins of picornaviridae. It is a highly disordered protein and its flexibility has been suggested to allow it to interact with many other viral proteins. VPg also interacts with various host proteins including eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E), eukaryotic elongation factor 1A (eEF1A), and poly(A) binding protein (PABP). NIb (~59 kDa) is a superfamily II RNA dependent RNA polymerase (RdRp) which polymerises viral RNA during replication. Like NIa, NIb forms inclusions in the host nucleus where it is transported due to its two nuclear localisation sequences. NIb has the three domain "palm, thumb, and fingers" structure typical of RdRps. 6K1 (~6 kDa) the function is not known, but because it accumulates in replication vesicles and has a transmembrane domain, 6K1 is thought to contribute to virus induced vesicle formation. 6K2 (~6 kDa) is a transmembrane protein which rearranges host membranes into virus induced membrane structures. It interacts with various ER exit site proteins to produce vesicular and tubular extensions which eventually mature into replication vesicles. 6K2 has three main domains: the N terminal domain which is required for cell to cell movement, the central hydrophobic transmembrane alpha helix, and the C terminal domain which is required for viral replication. P3N PIPO (~25 kDa) is a dedicated movement protein which anchors the movement complex to the plasmodesma. It may also modulate the plasmodesmatal size exclusion limit by interacting with host proteins which sever plasmodesmatal actin filaments and reduce callose deposition. It interacts with both the large and small subunits of the ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase. CP (~30 35 kDa) is the capsid protein. It has two terminal domains which are disordered and exposed at the surface of the virion. The central core domain contains an RNA binding pocket which binds to viral RNA. The structure of the capsid protein is highly conserved in potyviruses, though there is a relatively high degree of sequence variability. In addition to encapsidating the virion, CP core domain is required for intercellular movement and contributes to seed transmission. Certain atypical potyviruses code for additional proteins or protein domains, such as P1 PISPO, Alkylation B (AlkB), and inosine triphosphate pyrophosphatase (known as ITPase or HAM1). Such anomalies are often situated in the hypervariable P1 HC Pro region. They do not circulate or multiply within the aphid and typically only persist in the aphid for a few minutes. Certain potyviruses have been shown to alter the feeding patterns of their aphid vectors, which may manifest as longer periods of time spent on infected plants, reduced non probing feeding time, and increased phloem sap ingestion. Seed and pollen transmission has been documented in certain potyvirus species, for instance in PVY and Turnip mosaic virus (TUMV). Vegetative transmission by infected tubers or grafting material are of particular concern for certain agricultural crops, such as potato and fruit trees, respectively. Transmission can also occur by physical contact with infected plants or with contaminated tools, clothes, or even water.

Перевод

После проникновения частицы потивируса освобождаются от оболочки, и геномная РНК высвобождается в цитоплазму клетки-хозяина. Потивирусная РНК имитирует мРНК хозяина: 5'-белок VPg обладает функциональным сходством с 5'-кэпом, а 3'-конец полиаденилирован. Взаимодействие VPg с eIF4E и eIF4(iso)E позволяет вирусу использовать механизм трансляции клетки-хозяина, зависимый от кэпа, для собственной трансляции. Подобно эукариотической трансляции, взаимодействие VPg с eIF4E способствует сборке комплекса eIF4F вокруг вирусной РНК. У многих видов потивирусов идентифицировано несколько слабых внутренних участков инициации трансляции (IRES), однако не известно, играет ли независимая от кэпа трансляция важную роль в репликации потивирусов. Вирусный белок 6K2 координирует перестройку мембран клетки-хозяина в различные структуры, связанные с инфекцией, которые, в зависимости от вида потивируса, могут варьироваться от небольших округлых вирусных везикул до сложных глобулярных структур, содержащих множество цистерн или долей. Эти структуры усеяны вирусными комплексами репликации и часто называются «репликационными везикулами», «вироплазмой» или «вирусными фабриками». Мембраны репликационных везикул происходят из различных органелл клетки-хозяина, и источники различаются между разными видами потивирусов. К некоторым источникам мембран относятся эндоплазматическая сеть, хлоропласты, аппарат Гольджи и вакуоли. Точный механизм репликации неизвестен, но он включает в себя промежуточную отрицательно-смысловую РНК и требует как вирусных, так и клеточных белков. Вирусные белки, обнаруженные в комплексах репликации, включают HC Pro, P3, 6K1, 6K2, CI, VPg, NIa Pro и NIb. К факторам клетки-хозяина, присутствующим в репликационных везикулах, относятся eIF4A и несколько белков теплового шока.

Межклеточные движения

Как и большинство растительных вирусов, потивирусы эволюционировали для перемещения из одной растительной клетки в другую через плазмодесмы. Однако, в отличие от некоторых хорошо изученных растительных вирусов, таких как вирус табачной мозаики, у потивирусов нет единого белка, обеспечивающего перемещение, а вместо этого они формируют комплекс перемещения вокруг плазмодесмы. Этот комплекс состоит главным образом из трех вирусных белков: CI, CP, P3N PIPO. Конические инклюзии CI закрепляются на плазмодесмах P3N PIPO на ранних стадиях инфекции потивирусом. Это позволяет инклюзии направлять через плазмодезму либо вирусные частицы, либо комплексы вирусной РНК с CP. Репликационные везикулы также рекрутируются к комплексу перемещения, что указывает на связь между репликацией и перемещением. P3N PIPO рекрутирует репликационные везикулы, взаимодействуя как с CI, так и с P3 через общий домен P3N. Предполагается, что они эволюционировали в юго-западной Евразии или Северной Африке. Оценочная скорость мутации составляет около 1,15 нуклеотидных замен на сайт в год.

Географическое распространение

Сельское хозяйство было занесено в Австралию в 18 веке. Вместе с ним были завезены и патогены растений. В Австралии выделено 38 видов потивирусов. Восемнадцать потивирусов обнаружены исключительно в Австралии и, вероятно, являются эндемичными для этой территории. Оставшиеся двадцать, по всей видимости, были интродуцированы с развитием сельского хозяйства.

Диагностика

Исторически диагностика потивирусов основывалась на обнаружении различных белковых включений в инфицированных растительных клетках. Эти включения могут проявляться в виде кристаллов в цитоплазме или ядре, аморфных X-тел, мембранных тел, вируплазм или спиральных структур. Включения могут содержать вирионы, а могут и не содержать их (в зависимости от вида вируса). Эти включения можно увидеть при световой микроскопии в полосках листьев инфицированной растительной ткани, окрашенных оранжевым зеленым (белковым красителем), но не Azure A (красителем для нуклеиновых кислот). Современные методы обнаружения в основном основаны на обратной транскрипционной ПЦР.

Группы видов

В 1992 году потивирусы были дополнительно разделены на видовые группы PVY, SCMV, BYMV и BCMV. В 2010 году Гиббс и Ошима представили более развернутую молекулярную филогенезу, включающую те же четыре группы, а также несколько новых: BtMV, ChVMV, DaMV, OYDV, PRSV, TEV и TuMV.

PVY

Содержит 16 видов, включая типовой вид рода (вирус Y картофеля). Основные растения-хозяева: девять представителей семейства пасленовые, три – амарантовые, три – астровые, один – лилия и один – амариллис.