Вирус табачной мозаики: история открытия и исследования

Введение

Вирус, поражающий растения семейства Пасленовых.

Вирус табачной мозаики (TMV) – это одноцепочечный РНК-вирус с положительной полярностью, относящийся к роду Tobamovirus, который заражает широкий спектр растений, особенно табак и другие представители семейства Пасленовых. Инфекция вызывает характерные симптомы, такие как пятнистость и изменение окраски листьев, напоминающие "мозаику" (отсюда и название). TMV был первым открытым вирусом. Хотя о существовании не бактериального инфекционного заболевания, наносящего ущерб посевам табака, было известно с конца XIX века, лишь в 1930 году было установлено, что инфекционный агент является вирусом. Это первый патоген, идентифицированный как вирус. Вирус был кристаллизован Венделлом Мередитом Стэнли. Его размер сопоставим с размером самой крупной синтетической молекулы, известной как PG5.

История

В 1886 году Адольф Майер впервые описал болезнь табачной мозаики, которую можно передавать между растениями, подобно бактериальным инфекциям. В 1892 году Дмитрий Ивановский предоставил первое убедительное доказательство существования не бактериального инфекционного агента, показав, что зараженный сок оставался инфекционным даже после фильтрации через самые тонкие фильтры Чемберленда. Позже, в 1903 году, Ивановский опубликовал статью, описывающую аномальные кристаллические внутриклеточные включения в клетках-хозяевах пораженных табачных растений и предположил связь между этими включениями и инфекционным агентом. Однако Ивановский, несмотря на неоднократные неудачи в получении доказательств, оставался убежденным, что причиной заболевания является некультивируемая бактерия, слишком маленькая, чтобы задерживаться на используемых фильтрах Чемберленда и обнаруживаться в световом микроскопе. В 1898 году Мартинус Бейеринк независимо повторил фильтрационные эксперименты Ивановского и затем показал, что инфекционный агент способен воспроизводиться и размножаться в клетках-хозяевах табачного растения. Бейеринк принял термин «вирус» для обозначения того, что возбудитель болезни табачной мозаики имеет не бактериальную природу. Вирус табачной мозаики стал первым вирусом, который был кристаллизован. Это было достигнуто Уэнделлом Мередитом Стэнли в 1935 году, который также показал, что ТМВ сохраняет активность даже после кристаллизации, хотя позже было установлено, что некоторые его выводы (в частности, о том, что кристаллы представляют собой чистый белок и образуются путем автокатализа) были неверными. Первые электронно-микроскопические изображения ТМВ были получены в 1939 году Густавом Кауше, Эдгаром Пфанкухом и Гельмутом Руской – братом лауреата Нобелевской премии Эрнста Руски. В 1955 году Хайнц Френкель-Конрат и Робли Уильямс показали, что очищенная РНК ТМВ и ее капсидный белок самопроизвольно собираются в функциональные вирусы, что указывает на то, что это наиболее стабильная структура (обладающая самой низкой свободной энергией). Кристаллограф Розалинд Франклин работала у Стэнли около месяца в Беркли, а затем разработала и построила модель ТМВ для Всемирной выставки 1958 года в Брюсселе. В 1958 году она предположила, что вирус полый, а не твердый, и выдвинула гипотезу о том, что РНК ТМВ одноцепочечная. Это предположение было подтверждено после ее смерти и теперь известно как «плюс-цепь». Исследования болезни табачной мозаики и последующее открытие ее вирусной природы сыграли важную роль в формировании общих концепций вирусологии. Мономер белка состоит из 158 аминокислот, которые собраны в четыре основные альфа-спирали, соединенные заметной петлей, расположенной вблизи оси вириона. Вирионы имеют длину около 300 нм и диаметр около 18 нм. Электронные микрофотографии с отрицательным контрастированием показывают отчетливый внутренний канал радиусом около 2 нм. РНК расположена на расстоянии около 4 нм от оси и защищена от действия клеточных ферментов белком оболочки. Рентгенодифракционная структура волокна неповрежденного вируса была изучена на основе карты электронной плотности с разрешением 3,6 Å. Внутри спирали капсида, вблизи ядра, находится свернутая молекула РНК, состоящая из 6395 ± 10 нуклеотидов. Структура вируса играет важную роль в распознавании вирусной РНК. Это происходит благодаря образованию обязательного промежуточного продукта, образованного из белка, который позволяет вирусу распознавать специфическую шпилечную структуру РНК. Этот промежуточный продукт индуцирует нуклеацию самосборки ТМВ, связываясь со шпилечной структурой.

In 1886, Adolf Mayer first described the tobacco mosaic disease that could be transferred between plants, similar to bacterial infections. In 1892, Dmitri Ivanovsky gave the first concrete evidence for the existence of a non bacterial infectious agent, showing that infected sap remained infectious even after filtering through the finest Chamberland filters. Later, in 1903, Ivanovsky published a paper describing abnormal crystal intracellular inclusions in the host cells of the affected tobacco plants and argued the connection between these inclusions and the infectious agent. However, Ivanovsky remained rather convinced, despite repeated failures to produce evidence, that the causal agent was an unculturable bacterium, too small to be retained on the employed Chamberland filters and to be detected in the light microscope. In 1898, Martinus Beijerinck independently replicated Ivanovsky's filtration experiments and then showed that the infectious agent was able to reproduce and multiply in the host cells of the tobacco plant. Beijerinck adopted the term of "virus" to indicate that the causal agent of tobacco mosaic disease was of non bacterial nature. Tobacco mosaic virus was the first virus to be crystallized. It was achieved by Wendell Meredith Stanley in 1935 who also showed that TMV remains active even after crystallization. even though it was later shown some of his conclusions (in particular, that the crystals were pure protein, and assembled by autocatalysis) were incorrect. The first electron microscopical images of TMV were made in 1939 by Gustav Kausche, Edgar Pfankuch and Helmut Ruska – the brother of Nobel Prize winner Ernst Ruska. In 1955, Heinz Fraenkel Conrat and Robley Williams showed that purified TMV RNA and its capsid (coat) protein assemble by themselves to functional viruses, indicating that this is the most stable structure (the one with the lowest free energy). The crystallographer Rosalind Franklin worked for Stanley for about a month at Berkeley, and later designed and built a model of TMV for the 1958 World's Fair at Brussels. In 1958, she speculated that the virus was hollow, not solid, and hypothesized that the RNA of TMV is single stranded. This conjecture was proven to be correct after her death and is now known to be the + strand. The investigations of tobacco mosaic disease and subsequent discovery of its viral nature were instrumental in the establishment of the general concepts of virology. The protein monomer consists of 158 amino acids which are assembled into four main alpha helices, which are joined by a prominent loop proximal to the axis of the virion. Virions are ~300 nm in length and ~18 nm in diameter. Negatively stained electron microphotographs show a distinct inner channel of radius ~2 nm. The RNA is located at a radius of ~4 nm and is protected from the action of cellular enzymes by the coat protein. X ray fiber diffraction structure of the intact virus was studied based on an electron density map at 3.6 Å resolution. Inside the capsid helix, near the core, is the coiled RNA molecule, which is made up of 6,395 ±10 nucleotides. The structure of the virus plays an important role in the recognition of the viral DNA. This happens due to the formation of an obligatory intermediate produced from a protein allows the virus to recognize a specific RNA hairpin structure. The intermediate induces the nucleation of TMV self assembly by binding with the hairpin structure.

Геном

Геном TMV состоит из одноцепочечной (ss) РНК длиной 6,3–6,5 кб. 3'-конец имеет структуру, подобную тРНК, а 5'-конец – метилированную нуклеотидную «шапочку» (m7G5’pppG). Геном кодирует 4 открытые рамки считывания (ORF), две из которых приводят к образованию одного белка из-за рибосомного прочтения «протекающего» стоп-кодона UAG. Четыре гена кодируют репликазу (с доменами метилтрансферазы [MT] и РНК-геликазы [Hel]), РНК-зависимую РНК-полимеразу, так называемый белок движения (MP) и белок капсида (CP). Кодирующая последовательность начинается с первой рамки считывания, отстоящей на 69 нуклеотидов от 5'-конца РНК. Некодирующая область на 5'-конце может варьироваться у разных вирионов, но каких-либо изменений в некодирующей области на 3'-конце между вирионами не обнаружено. Показатель преломления TMV составляет около 1,57.

Цикл болезни

У TMV нет отчетливой структуры для перезимовки. Вместо этого он перезимовывает в зараженных стеблях и листьях табака в почве, на поверхности зараженных семян (ТМВ может даже выживать в зараженных табачных изделиях в течение многих лет, поэтому курильщики могут случайно передать его прикосновением, хотя и не через сам дым). Однако вирус распространяется не воздушно-капельным путем, а при прямом контакте с соседними клетками. Для облегчения проникновения TMV производит белок движения массой 30 кДа, называемый P30, который расширяет плазмодесмы. Вероятно, TMV перемещается из клетки в клетку в виде комплекса, состоящего из РНК, P30 и белков репликации. Он также может распространяться по флоэме для перемещения на большие расстояния внутри растения. Более того, TMV может передаваться от одного растения к другому при прямом контакте. Хотя TMV не имеет определенных переносчиков, вирус легко передается от зараженных растений к здоровым при контакте с человеком.

Репликация

После проникновения в клетку хозяина посредством механической инокуляции, TMV высвобождает свою вирусную [+]РНК-цепочку, удаляя свою оболочку. По мере удаления оболочки, ген MetHel:Pol транслируется с образованием фермента MetHel и РНК-полимеразы. Затем вирусный геном реплицируется, производя множество мРНК через промежуточный [ ]РНК, инициацию которого осуществляет tRNAHIS на 3'-конце [+]РНК. Полученные мРНК кодируют несколько белков, включая белок капсида и РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), а также белок, отвечающий за передвижение вируса. Таким образом, TMV способен реплицировать свой геном. После синтеза белка капсида и РНК-генома TMV, они спонтанно собираются в полноценные вирионы TMV в ходе высокоорганизованного процесса. Протомеры объединяются, формируя диски или "шайбы", состоящие из двух слоев протомеров, расположенных по спирали. Спиральная капсида растет за счет присоединения протомеров к концу стержня. По мере удлинения стержня, РНК проходит через канал в его центре и образует петлю на растущем конце. Это позволяет РНК легко упаковываться в виде спирали во внутреннее пространство спиральной капсиды.

Присутствие и симптомы

Как и другие вирусы, вызывающие заболевания растений, ТМВ имеет очень широкий круг хозяев и оказывает различное воздействие в зависимости от заражаемого растения. Известно, что вирус табачной мозаики может приводить к потерям урожая табака, высушенного на воздухе, до двух процентов в Северной Каролине. Он способен заражать представителей девяти семейств растений, а также по крайней мере 125 отдельных видов, включая табак, томаты, перец (все относящиеся к семейству Solanaceae), огурцы, множество декоративных цветов и бобовые, такие как Phaseolus vulgaris и Vigna unguiculata.

Окружающая среда

ТМВ – один из самых устойчивых вирусов, обладающий широким диапазоном выживаемости. Пока температура окружающей среды не превышает примерно 40 градусов Цельсия, ТМВ сохраняет свою стабильную форму. Ему нужен лишь хозяин для заражения. В случае необходимости, теплицы и ботанические сады создают наиболее благоприятные условия для распространения ТМВ из-за высокой плотности потенциальных хозяев и стабильной температуры в течение года. Кроме того, ТМВ можно успешно культивировать in vitro в соке, поскольку он способен сохранять жизнеспособность до 3000 дней.

Лечение и управление

Одним из распространенных методов борьбы с ТМВ является санитария, включающая удаление зараженных растений и мытье рук между посадками. Также следует применять севооборот, чтобы избежать заражения почвы/посевных грядок в течение как минимум двух лет. Как и в случае любого заболевания растений, рекомендуется искать устойчивые сорта к ТМВ. Кроме того, можно использовать метод перекрестной защиты, при котором более сильный штамм инфекции ТМВ подавляется заражением растения-хозяина слабым штаммом ТМВ, что аналогично эффекту вакцины. За последние десять лет разработана технология применения генной инженерии к геному растения-хозяина, позволяющая растению-хозяину производить белок оболочки ТМВ внутри своих клеток. Предполагалось, что геном ТМВ будет быстро переоболочен при попадании в клетку-хозяина, тем самым предотвращая начало репликации ТМВ. Позже было установлено, что механизм, защищающий хозяина от внедрения вирусного генома, заключается в подавлении генов. ТМВ ингибируется продуктом слизевика Physarum polycephalum. Как табак, так и бобы P. vulgaris и V. sinensis практически не поражались ТМВ in vitro при обработке экстрактом P. polycephalum. Исследование, проведенное Х. Френкелем Конратом, показало влияние уксусной кислоты на вирус табачной мозаики. Согласно исследованию, 67% уксусной кислоты приводила к деградации вируса. Другим возможным способом профилактики ТМВ является использование салициловой кислоты. Исследование, проведенное исследовательской группой Кембриджского университета, показало, что обработка растений салициловой кислотой снижает количество вирусной РНК ТМВ и вирусного белка в растениях табака. Их исследование показало, что салициловая кислота, вероятно, нарушает репликацию и транскрипцию, в частности, комплекс RdRp. Проведенное исследование показало, что у людей есть антитела к вирусу табачной мозаики.

Научное и экологическое воздействие

Большой объем литературы, посвященной ТМВ, и его выбор для многих основополагающих исследований в структурной биологии (включая рентгеновскую дифракцию и рентгеноструктурный анализ), сборку и распад вируса, и тому подобное, обусловлены, прежде всего, возможностью получения его в больших количествах, а также тем, что он не заражает животных. Выращивание нескольких сотен зараженных табачных растений в теплице с последующим проведением нескольких простых лабораторных процедур позволяет ученому получить несколько граммов вируса. Фактически, вирус табачной мозаики настолько продуктивен, что включения можно увидеть даже в световой микроскоп.

Приложения

Вирусы растений могут использоваться для создания вирусных векторов – инструментов, обычно применяемых молекулярными биологами для доставки генетического материала в растительные клетки; они также служат источниками биоматериалов и нанотехнологических устройств. Вирусные векторы на основе TMV включают технологии экспрессии растений magnICON и TRBO. Благодаря своей цилиндрической форме, высокому соотношению сторон, способности к самосборке и возможности внедрения металлических покрытий (никеля и кобальта) в свою оболочку, TMV является идеальным кандидатом для использования в электродах аккумуляторов. Добавление TMV к электроду аккумулятора увеличивает площадь реактивной поверхности в десять раз, что приводит к увеличению емкости аккумулятора до шести раз по сравнению с плоским электродом. Вектор на основе TMV также позволил грибу *C. acutatum* временно экспрессировать экзогенный GFP в течение шести субкультур и не менее двух месяцев после заражения, без необходимости разработки технологии трансформации. РНК-интерференция может быть использована для экспрессии в фитопатогенном грибе *Colletotrichum acutatum* с помощью VIGS, используя рекомбинантный вектор на основе TMV, в котором ORF гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), транскрибируется в грибковых клетках с дубликата субгеномного промотора мРНК белка оболочки TMV (CP). Было показано, что этот подход может быть использован для получения экспрессии чужеродных белков в грибах.