ДНК-оригами: Сборка наноструктур из ДНК.

Введение

Сворачивание ДНК для создания двух- и трехмерных структур в наномасштабе.

ДНК-оригами – это сворачивание ДНК в наномасштабе для создания произвольных двух- и трехмерных структур. Специфичность взаимодействий между комплементарными парами оснований делает ДНК полезным конструкционным материалом, посредством проектирования последовательностей этих оснований. ДНК – хорошо изученный материал, подходящий для создания каркасов, удерживающих другие молекулы, или для самостоятельного формирования структур. ДНК-оригами было представлено на обложке журнала Nature 16 марта 2006 года. С тех пор ДНК-оригами перестало быть исключительно формой искусства и нашло множество применений, от систем доставки лекарств до использования в качестве цепей в плазмонических устройствах; однако большинство коммерческих приложений пока находятся на стадии разработки или тестирования.

Обзор

Идея использования ДНК в качестве строительного материала была впервые предложена в начале 1980-х годов Надрианом Симаном. Метод ДНК-оригами был разработан Полом Ротэмундом в Калифорнийском технологическом институте. В отличие от распространенных методов создания объектов сверху вниз, таких как 3D-печать или литография, которые предполагают нанесение или удаление материала с помощью инструмента, ДНК-нанотехнология, а также ДНК-оригами как ее подраздел, является методом создания объектов снизу вверх. Путем рационального проектирования составляющих субъединиц ДНК-полимера, ДНК может самособираться в различные формы. Процесс создания ДНК-оригами включает в себя складывание длинной одноцепочечной вирусной ДНК (обычно геномной ДНК M13 бактериофага длиной 7249 пар оснований) при помощи множества более коротких "скрепляющих" цепей. Эти короткие цепи связываются с более длинной цепью в различных местах, что приводит к формированию заранее определенной двух- или трехмерной структуры. Примеры включают смайлик и схематичную карту Китая и Америки, а также множество трехмерных структур, таких как кубы. Существует несколько свойств ДНК, которые делают эту молекулу идеальным строительным материалом для ДНК-оригами. Цепи ДНК естественным образом стремятся связываться со своими комплементарными последовательностями посредством водородных связей между основаниями Уотсона — Крика. Это позволяет скрепляющим цепям находить свое место на каркасной цепи без какого-либо внешнего воздействия, что приводит к самосборке желаемой структуры. Специфическая последовательность оснований в ДНК придает материалу элемент программируемости, определяя его способность к связыванию. Тщательно продуманная последовательность скрепляющих цепей позволяет ученым точно направлять складывание каркасной цепи в заранее определенную форму с высокой точностью. На химическом уровне, водородные связи между комплементарными парами оснований обеспечивают прочность и стабильность сложенных структур ДНК-оригами. Кроме того, ДНК является относительно стабильной молекулой, обеспечивающей устойчивость в физиологических условиях. При проектировании некоторых других ДНК-наноструктур может оказаться непрактичным проектировать огромное количество индивидуальных цепей, если вся структура состоит из более коротких цепей. Один из способов избежать необходимости в большом количестве различных цепей — использовать повторяющиеся элементы, что, однако, приводит к распределению по размерам и иногда по форме. ДНК-оригами, напротив, формирует дискретные структуры. Помимо этих наиболее распространенных методов, существуют дополнительные способы создания динамических машин ДНК-оригами, такие как проектирование направленного компонента и использование броуновского движения для вращения структур или использование менее распространенных явлений самосборки ДНК, таких как G-квадруплексы или i-мотивы, которые могут быть чувствительны к pH. Модификации могут быть использованы для изменения структурных свойств, придания наноструктурам уникальной химии или добавления чувствительности к внешним стимулам. Модификации структур могут быть внесены путем конъюгации молекул, таких как белки, или путем химической модификации самих оснований ДНК. В модифицированных системах продемонстрирована зависимость от pH, зависимость от света и другие виды реакций. Одним из примеров применения создания динамических структур является возможность получения реакции на стимул, приводящей к высвобождению лекарственного препарата, что было продемонстрировано несколькими группами. Другие, менее распространенные области применения включают в себя обнаружение движущихся механизмов in vivo, таких как раскручивание геликаз.

The idea of using DNA as a construction material was first introduced in the early 1980s by Nadrian Seeman. The method of DNA origami was developed by Paul Rothemund at the California Institute of Technology. In contrast to common top down fabrication methods such as 3D printing or lithography which involve depositing or removing material through a tool, DNA Nanotechnology, as well as DNA Origami as a subset, is a bottom up fabrication method. By rationally designing the constituent subunits of the DNA polymer, DNA can self assemble into a variety of shapes. The process of constructing DNA Origami involves the folding of a long single strand of viral DNA (typically the 7,249 bp genomic DNA of M13 bacteriophage) aided by multiple smaller "staple" strands. These shorter strands bind the longer in various places, resulting in the formation of a pre defined two or three dimensional shape. Examples include a smiley face and a coarse map of China and the Americas, along with many three dimensional structures such as cubes. There are several DNA properties that make the molecule an ideal building material for DNA origami. DNA strands have a natural tendency to bind to their complementary sequences through Watson–Crick base pairing. This allows staple strands to locate the position on the scaffold strand without any external manipulation, leading to self assembly of the desired structure. The specific sequence of bases in DNA gives the material an element of programmability by determining its binding behavior. Carefully designing the sequences of the staple strands enables scientists to precisely direct the scaffold strand’s folding into a predetermined shape with high precision. On a chemical level, the hydrogen bonds that exist between the complementary base pairs provide strength and stability to the folded DNA origami structures. Additionally, DNA is a relatively stable molecule, offering resilience in physiological conditions. In the design of some other DNA nanostructures, it can be impractical to design the extremely large number of individualized strands if the entire structure is composed of smaller strands. One method of bypassing the need for a huge number of different strands is to use repeating units, which comes with the disadvantage of a distribution of sizes and sometimes shapes. DNA Origami, however, forms discrete structures. While these methods are most commonly used, additional methods for creating dynamic DNA Origami machines exist, such as designing a directional component and using brownian motion to drive rotational movement of structures or leveraging less commonly used DNA self assembly phenomena like G quadruplexes or i motifs which can be pH sensitive. Modifications can be otherwise used to affect structural properties, to impart unique chemistry to the nanostructures, or to add stimuli responses to the nanostructures. Modifications to structures can be made through conjugation of molecules such as proteins, or through chemical modification of the DNA bases themselves. pH dependent responses, light dependent responses, and more have been shown through modified systems. One example application of creating dynamic structures is the ability to have a stimuli response resulting in drug release, which is presented by several groups. Other, less common applications comes in sensing moving mechanisms in vivo such as the unwinding of helicase.

Применения нанотехнологий

В литературе предложено множество потенциальных применений, включая иммобилизацию ферментов, системы доставки лекарственных средств и нанотехнологическую самосборку материалов. Хотя ДНК не является естественным выбором для создания активных структур для нанороботических приложений из-за недостатка структурной и каталитической универсальности, ряд работ исследовал возможность создания молекулярных ходоков на основе оригами и переключателей для алгоритмических вычислений. В следующих разделах перечислены некоторые из заявленных применений, выполненных в лабораториях и обладающих клиническим потенциалом. В исследовании, проведенном группой ученых из центра iNANO и CDNA Center при университете Орхуса, исследователям удалось сконструировать небольшую многопереключающуюся 3D-коробку из ДНК-оригами. Предложенная наночастица была охарактеризована методами АФМ, ПЭМ и FRET. Было показано, что сконструированная коробка обладает уникальным механизмом повторного закрытия, позволяющим ей многократно открываться и закрываться в ответ на уникальный набор ДНК- или РНК-ключей. Авторы предположили, что это "ДНК-устройство потенциально может быть использовано в широком спектре приложений, таких как контроль функции отдельных молекул, контролируемая доставка лекарств и молекулярные вычисления". Нанороботы, созданные из ДНК-оригами, продемонстрировали вычислительные возможности и выполнили предварительно запрограммированную задачу внутри живого организма, о чем сообщила команда биоинженеров из Института Висса при Гарвардском университете и Института нанотехнологий и передовых материалов при Университете Бар-Илана. В качестве доказательства концепции команда вводила различные типы нанороботов (свернутую ДНК, заключающую в себе молекулы с флуоресцентными метками) живым тараканам. Отслеживая метки внутри тараканов, команда обнаружила, что точность доставки молекул (высвобождаемых развернутой ДНК) в целевые клетки, взаимодействие между нанороботами и управление эквивалентны компьютерной системе. Сложность логических операций, принимаемых решений и выполняемых действий возрастает с увеличением числа нанороботов. Команда оценила, что вычислительная мощность внутри таракана может быть увеличена до уровня 8-битного компьютера. Исследовательская группа из Индийского института науки использовала наноструктуры для разработки платформы, позволяющей изучить коаксиальное укладки между основаниями ДНК. Этот подход использовал сверхразрешающую микроскопию на основе ДНК PAINT для визуализации этих ДНК-наноструктур и анализ кинетики связывания ДНК для выяснения фундаментальной силы укладки оснований, которая способствует стабилизации двойной спиральной структуры ДНК. Затем они собрали мультимерные ДНК-оригами наноструктуры, названные "трехконечной звездой", в тетраэдрическую 3D-структуру оригами. Сборка в основном опиралась на взаимодействие укладки оснований между каждой субъединицей. Группа также показала, что знание этих взаимодействий можно использовать для прогнозирования и, следовательно, настройки относительной стабильности этих мультимерных ДНК-наноструктур.

Many potential applications have been suggested in literature, including enzyme immobilization, drug delivery systems, and nanotechnological self assembly of materials. Though DNA is not the natural choice for building active structures for nanorobotic applications, due to its lack of structural and catalytic versatility, several papers have examined the possibility of molecular walkers on origami and switches for algorithmic computing. The following paragraphs list some of the reported applications conducted in the laboratories with clinical potential. In a study conducted by a group of scientists from iNANO center and CDNA Center at Aarhus university, researchers were able to construct a small multi switchable 3D DNA Box Origami. The proposed nanoparticle was characterized by AFM, TEM and FRET. The constructed box was shown to have a unique reclosing mechanism, which enabled it to repeatedly open and close in response to a unique set of DNA or RNA keys. The authors proposed that this "DNA device can potentially be used for a broad range of applications such as controlling the function of single molecules, controlled drug delivery, and molecular computing." Nanorobots made of DNA origami demonstrated computing capacities and completed pre programmed task inside the living organism was reported by a team of bioengineers at Wyss Institute at Harvard University and Institute of Nanotechnology and Advanced Materials at Bar Ilan University. As a proof of concept, the team injected various kinds of nanobots (the curled DNA encasing molecules with fluorescent markers) into live cockroaches. By tracking the markers inside the cockroaches, the team found the accuracy of delivery of the molecules (released by the uncurled DNA) in target cells, the interactions among the nanobots and the control are equivalent to a computer system. The complexity of the logic operations, the decisions and actions, increases with the increased number of nanobots. The team estimated that the computing power in the cockroach can be scaled up to that of an 8 bit computer. A research group at the Indian Institute of Science used nanostructures to develop a platform to elucidate the coaxial stacking between DNA bases. This approach utilized DNA PAINT based super resolution microscopy for visualizing these DNA nanostructures and performed DNA binding kinetics analysis to elucidate the fundamental force of base stacking that helps stabilize the DNA double helical structure. They went on to assemble multimeric DNA origami nanostructures termed as a 'three point star' into a tetrahedral 3D origami structure. The assembly relied chiefly on base stacking interactions between each subunit. The group further showed that the knowledge of such interactions can be used to predict and thus tune the relative stabilities of these multimeric DNA nanostructures.

Подобные подходы

Идея использования белкового дизайна для достижения тех же целей, что и ДНК-оригами, также возникла. Исследователи из Национального института химии в Словении работают над рациональным проектированием сворачивания белков для создания структур, подобных тем, что получаются при ДНК-оригами. Основное направление современных исследований в области проектирования сворачивания белков – это доставка лекарств, с использованием антител, присоединенных к белкам, в качестве способа создания адресной системы доставки.