Введение
Искусственные биохимические рецепторы, реагирующие только на предварительно разработанные лекарственные препараты. Рецептор, активируемый исключительно синтетическим лигандом (RASSL), или дизайнерский рецептор, активируемый исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD), представляет собой класс искусственно сконструированных белковых рецепторов, используемых в области химиогенетики, которые селективно активируются определенными лигандами. Они применяются в биомедицинских исследованиях, в частности в нейробиологии, для манипулирования активностью нейронов. Изначально различавшиеся по подходу к их конструированию, RASSL и DREADD часто используются как взаимозаменяемые термины для обозначения сконструированной системы рецептор-лиганд. Эти системы обычно используют рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), разработанные для реагирования исключительно на синтетические лиганды, такие как N-оксид клозапина (CNO), а не на эндогенные лиганды. Существует несколько типов этих рецепторов, производных от мускариновых или κ-опиоидных рецепторов. Для получения мутантного рецептора с наномолярной аффинностью к CNO, нечувствительностью к ацетилхолину и низкой конститутивной активностью потребовалось всего две точечные мутации hM3, и этот DREADD-рецептор был назван hM3Dq. Мутации мускариновых рецепторов M1 и M5 привели к созданию DREADD hM1Dq и hM5Dq соответственно. Также были разработаны DREADD, связанные с Gs. Эти рецепторы также известны как GsD и являются химерными рецепторами, содержащими внутриклеточные области β-адренергического рецептора эритроцитов индейки, встроенные в крысиный M3 DREADD.
A receptor activated solely by a synthetic ligand (RASSL) or designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADD), is a class of artificially engineered protein receptors used in the field of chemogenetics which are selectively activated by certain ligands. They are used in biomedical research, in particular in neuroscience to manipulate the activity of neurons. Originally differentiated by the approach used to engineer them, RASSLs and DREADDs are often used interchangeably now to represent an engineered receptor ligand system. These systems typically utilize G protein coupled receptors (GPCR) engineered to respond exclusively to synthetic ligands, like clozapine N oxide (CNO), and not to endogenous ligands. Several types of these receptors exists, derived from muscarinic or κ opioid receptors. Only two point mutations of hM3 were required to achieve a mutant receptor with nanomolar potency for CNO, insensitivity to acetylcholine and low constitutive activity and this DREADD receptor was named hM3Dq. M1 and M5 muscarinic receptors have been mutated to create DREADDs hM1Dq and hM5Dq respectively. Gs coupled DREADDs have also been developed. These receptors are also known as GsD and are chimeric receptors containing intracellular regions of the turkey erythrocyte β adrenergic receptor substituted into the rat M3 DREADD.
Лиганды RASSL / DREADD
Все больше лигандов, которые могут быть использованы для активации RASSL / DREADD, становятся коммерчески доступными. CNO является прототипическим активатором DREADD. CNO активирует возбуждающие DREADD, сопряженные с Gq: hM3Dq, hM1Dq и hM5Dq, а также ингибирующие DREADD, сопряженные с Gi: hM4Di и hM2Di. CNO также активирует DREADD, сопряженный с Gs (GsD), и DREADD, предпочитающий β-аррестин: rM3Darr (Rq(R165L)). Недавние исследования показывают, что CNO, вводимый системно, не легко проникает через гематоэнцефалический барьер in vivo и превращается в клозапин, который сам по себе активирует DREADD. Клозапин – это атипичный антипсихотический препарат, демонстрирующий высокую аффинность и потенцию к DREADD. Субпороговые инъекции самого клозапина могут быть использованы для индуцирования предпочтительного поведения, опосредованного DREADD. Поэтому при использовании CNO необходимо проявлять осторожность при разработке эксперимента и включать соответствующие контроли. Агонист DREADD 21, также известный как Compound 21, представляет собой альтернативный агонист для мускариновых DREADD и альтернативу CNO. Сообщается, что Compound 21 обладает отличной биодоступностью, фармакокинетическими свойствами и проницаемостью через гематоэнцефалический барьер, а также не подвергается обратному метаболизму в клозапин. Другой известный агонист – перлапин, гипнотический препарат, одобренный для лечения бессонницы в Японии. Он действует как активатор DREADD, сопряженных с Gq, Gi и Gs, и имеет структурное сходство с CNO. Более поздним агонистом hM3Dq и hM4Di является десхлороклозапин (DCZ). С другой стороны, SalB B является мощным и селективным активатором KORD. JHU37160 и JHU37152 были коммерциализированы как новые лиганды DREADD, активные in vivo, с высокой потенцией и аффинностью к DREADD hM3Dq и hM4Di. Дигидрохлоридные соли лигандов DREADD, растворимые в воде (но с различной стабильностью в растворе), также были коммерчески разработаны (см. информацию о стабильности в водной среде).
Механизм
RASSL и DREADD – это семейства искусственно созданных рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), разработанных специально для обеспечения точного пространственно-временного контроля GPCR-сигнализации in vivo. Эти сконструированные GPCR не реагируют на эндогенные лиганды, но могут быть активированы наномолярными концентрациями фармакологически инертных малых молекул, подобных лекарственным препаратам. В настоящее время существуют RASSL для изучения нескольких сигнальных путей GPCR, включая пути, активируемые Gs, Gi, Gq, Golf и β-аррестином. Важным фактором успеха ресурсов RASSL стал открытый обмен ДНК-конструкциями и сопутствующими ресурсами, связанными с RASSL. Ингибирующий эффект DREADD hM4Di обусловлен стимуляцией CNO и последующей активацией калийных каналов, внутрь выпрямляющих ток, связанных с G-белком (GIRK). Это вызывает гиперполяризацию целевой нейронной клетки и, таким образом, снижает ее последующую активность.
Применение
Этот химиогенетический метод может быть использован для дистанционного управления клетками, в особенности возбудимыми клетками, такими как нейроны, как in vitro, так и in vivo при введении специфических лигандов. Благодаря способности модулировать нейронную активность, DREADDs используются как инструмент для изучения как нейронных путей, так и поведения, связанного с сигналами, вызывающими зависимость, и наркотической зависимостью.
История
Страдер и его коллеги разработали первый GPCR, который активируется исключительно синтетическим соединением и постепенно приобретает популярность. Первая международная встреча RASSL была запланирована на 6 апреля 2006 года. Мюллер и др. (2005) привели простой пример использования системы RASSL в поведенческой генетике, показав, что экспрессия рецептора RASSL в клетках, отвечающих за восприятие сладкого вкуса на языке мыши, привела к выраженному предпочтению употребления синтетического лиганда внутрь, тогда как экспрессия RASSL в клетках, отвечающих за восприятие горького вкуса, вызвала резкое отвращение к этому же соединению. Ослабляющее действие hM4Di DREADD было впервые исследовано в 2007 году, а затем подтверждено в 2014 году.